Ghrelin在维生素D3联合尼古丁建立大鼠血管钙化模型中的作用

马涛 王倩 程治源 叶挺 张宸铭 盛瑛 宗刚军

【摘要】目的 建立大鼠血管钙化模型并探胃饥饿素（Ghrelin）在血管钙化中的作用。方法 将40只8周龄无特定病原体讨的SD大鼠随机分为四组：钙化组、对照组、钙化+低浓度Ghrelin组、钙化+高浓度Ghrelin组。钙化组用尼古丁灌胃（溶解于花生油中，25mg/kg，第一天8:00am与6:00pm各一次）联合维生素D3（溶解于无水乙醇，30万U/kg）肌肉注射；对照组仅用花生油和无水乙醇做相同处理，低浓度和高浓度Ghrelin组分别在尼古丁联合维生素D3处理基础上分别腹腔注射50ug/kg，100ug/kg浓度的Ghrelin每日一次，连续注射四周。用Von Kossa切片染色观察大鼠胸主动脉血管钙化程度，用酶联免疫修复（ELISA）方法检测四组碱性磷酸酶（ALP）、钙离子（Ca2+）、人类骨形成蛋白4（BMP-4）含量，蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）法检测四组人类骨形成蛋白-2（BMP-2）、BMP-4的表达。结果 钙化组Von Kossa切片染色可见大鼠胸主动脉壁中层大量黑褐色钙盐沉积，严重程度明显高于其他三组，高浓度Ghrelin组钙化程度明显低于低浓度Ghrelin组，对照组钙化程度最轻；并且通过ELISA法测得钙化组大鼠胸主动脉血清BMP-4含量（144.3±17.9pg/dl）最高，低浓度Ghrelin组（131.3±12.35pg/dl）高于高浓度Ghrelin组（115.6±8.46pg/dl），对照组最低（89.67±16.04pg/dl），同样方法测得四组血清ALP和Ca2+含量具有相同变化趋势；Western blot结果显示钙化组BMP-2、BMP-4的表达也明显高于其他三组，高浓度Ghrelin组与低浓度Ghrelin相比BMP-2、BMP-4的表达减少，但高于对照组。差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 维生素D3肌肉注射联合尼古丁灌胃可以建立大鼠血管钙化模型；Ghrelin可以减缓及抑制钙化的发生及发展。

【关键词】胃饥饿素；大鼠；血管钙化

The effect of ghrelin in the establishment of rat model of vascular calcification by vitamin D3 combined with nicotine in vitro

Tao Ma, Qian Wang, Zhiyuan Cheng, Ting Ye, Chenming Zhang ,Ying Sheng ,Gangjun Zong

Department of Cardiology, 101 Hospital of PLA, Wuxi, Jiangsu Province, China 214044

【基金项目】: 国家自然科学基金（NO.81371657）,无锡地区心脏瓣膜钙化流行病学调查及主要发病机制的相关研究（Z201608）

【作者单位】：解放军第一O一医院心血管内科

【通讯作者】：宗刚军， Email: zonggj@163.com

[Abstract] Objective Establishment of rat vascular calcification model and Exploration of the Effect of Ghrelin on Vascular Calcification . Methods Forty Sprague Dawley rats aged 8 weeks without specific pathogens were randomly divided into four groups: calcification group, control group, calcification + low concentration Ghrelin group, calcification + high concentration Ghrelin group. In the calcification group, nicotine was intragastrically administered (25 mg/kg dissolved in peanut oil, 8 in the morning and 6 in the evening), and vitamin D3 (300,000 U/kg dissolved in anhydrous ethanol) was intramuscularly injected; The control group only used peanut oil and anhydrous ethanol, low concentration and high concentrations of ghrelin group were given intraperitoneal injection of different concentrations of ghrelin once a day(50ug/kg，100ug/kg)respectively, on the basis of calcification, continuous intervention for four weeks. The degree of calcification of rat thoracic aorta was observed by Von Kossa section staining. Four groups of alkaline phosphatase (ALP), calcium ion (Ca2+) and human bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).  Western Blot assay was used to detect the expression of four human bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and BMP-4.Results The calcification group showed a large amount of dark brown calcium deposits in the middle wall of rat thoracic aorta by Von Kossa staining, and the severity was significantly higher than that of the other three groups. The calcification degree of the high concentration ghrelin group was lower than that of the low concentration ghrelin group, and the calcification degree of the control group was the lightest.The serum BMP-4 content of the thoracic aorta in the calcified group was the highest (144.3±17.9pg/dl), and the low-concentration Ghrelin group (131.3±12.35pg/dl) was higher than the high-concentration Ghrelin group (115.6±8.46)pg/dl), the lowest in the control group (89.67±16.04pg/dl), the same method showed that the serum ALP and Ca2+ content of the four groups had the same trend. Western blot analysis showed that the expression of BMP-2 and BMP-4 in the calcified group was significantly higher than that in the other three groups. The expression of BMP-2 and BMP-4 was lower in the high-concentration Ghrelin group than in the low-concentration Ghrelin, but higher than that in the control group. The difference was statistically significant (P < 0.05).Conclusion Nicotine gavage combined with intramuscular injection of vitamin D3 can establish rat vascular calcification model; Ghrelin can slow down and inhibit the occurrence and development of calcification.

[Key words] Ghrelin, Rat model ,Vascular Calcification 

钙在人体内大量存在，构成骨骼作为支持人体的支架，在分泌、运送、肌肉收缩、神经传导等方面也起着重要的作用。钙在人体内以两种形式存在，一种是钙离子，存在血液循环内，即所谓血钙；另外一种即结合钙，和蛋白、碳酸或者磷酸结合而沉积在组织内，在某些情况下钙析出成固体并沉着于组织内，称为病理性钙盐沉积。胃饥饿素（Ghrelin）是生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor,GHS-R）的内源性配体，由28个氨基酸残基组成的小分子多肽^[1-2]。有研究表明钙化和免疫及炎症反应有直接相关性，此外，也有研究发现Ghrelin能够阻碍炎症细胞聚集和活化^[3]，抑制细胞炎症因子包括核因子-кB（NF-κB），血管细胞粘附分子1（VCAM-1）和细胞内粘附分子1的产生延缓动脉粥样硬化的进展^[4] 。在临床中，血管钙化是高血压、冠状动脉粥样硬化、慢性肾衰竭以及糖尿病血管病变共同的病理基础，钙化是一个复杂的过程，包括异常的矿物质代谢沉积，钙化抑制剂失调（例如，基质Gla蛋白[MGP]），血管平滑肌细胞（VSMC）向骨/软骨分化，VSMC凋亡以及基质囊泡释放以及氧化低密度脂蛋白的过度表达^[5-6]。血管钙化多发生在动脉中层，近些年来实验证实在血管动脉中层细胞发生坏死和凋亡后释放出的基质囊泡是血管发生钙化的启动环节，通过干预血管中层细胞的坏死和凋亡可以抑制血管钙化的进展^[7]。血管钙化与动脉粥样硬化，糖尿病和慢性肾病（CKD）患者的心血管发病率和死亡率增加有关^[8]。  然而，针对血管钙化的可行的治疗方法是有限的。本研究拟通过体内实验，采用维生素D3、尼古丁等因素干预，建立体内血管钙化模型，探讨Ghrelin与血管钙化程度之间的相关性，旨在寻找干预钙化的新靶点，为延缓血管钙化进程提供了新的方向。

材料与方法

1. 材料：雄性无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级SD大鼠由江苏省血吸虫病防治研究所提供，平均8周龄，160-250g。尼古丁购自Merck公司，维生素D3购自Sigma公司，纯度>99%；Ghrelin购自杭州中肽生物有限公司，纯度> 99%。钙离子及碱性磷酸酶试剂盒军购自索莱宝公司，BMP-4试剂盒购自美国R&D公司。一坑及二抗购自碧云天公司。其他试剂由联科生物公司提供。

2. 大鼠钙化模型的建立：将40只同一批次SD大鼠随机分成4组，每组10只，分别为钙化组（VC）、对照组(CON)、钙化+低浓度组(L-Ghre)、钙化+高浓度组（H-Ghre）。钙化组：第一天08：00用维生素D3溶解于无水乙醇（300000U/kg）肌肉注射，尼古丁溶解于花生油（25mg/kg）08：00,18:00各灌胃一次。对照组：同样时间用同等量的无水乙醇肌肉注射，花生油灌胃。钙化+低浓度组：用同钙化组相同方法建立模型的基础上给予Ghrelin, 50ug/kg，腹腔注射，每日一次，持续四周。钙化+高浓度组：在钙化模型基础上给予Ghrelin,100ug/kg, 腹腔注射，每日一次，持续四周。四周后四组大鼠称重后均在10%丙戊酸钠麻醉后心脏取血，3000r/min，10min离心后取上清，-80℃保存待测。解剖大鼠取胸主动脉1cm，10%中性福尔马林固定留待切片染色。

3. Von Kossa切片染色：原理是利用金属置换方法，Von Kossa银溶液作用于含有钙盐切片时，钙被银所置换，银盐在紫外光的照射下被还原为黑色金属，适用于大量样本的钙盐组织染色。将固定于10%中性福尔马林的1cm胸主动脉常规脱水包埋，切片厚度2μm常规脱蜡至水，蒸馏水洗1min，切片入Von Kossa银溶液在紫外灯下强光照射10min后蒸馏水再洗1min，切片用海波溶液处理2min后蒸馏水冲洗3次，脱水透明，中性树胶封固。

4. 血清Ca2+、胸主动脉ALP及BMP-4、测定：大鼠血清离心后上清中的Ca2+、胸主动脉ALP及BMP-4含量用ELISA法进行检测。解剖后的大鼠取胸主动脉称重100mg冰浴匀浆离心后吸出上清，置于-20℃待测。具体操作步骤按照ELISA试剂盒说明进行。

5.胸主动脉BMP-2、BMP-4表达：取胸主动脉并剪成细小碎片，加入终浓度为1mM的PMSF，每20mg组织加入200μl的RIPA裂解液并震荡裂解液，玻璃器匀浆至充分裂解，12000×g离心5min取上清液，加入上样缓冲液并煮沸，再次离心，其余步骤按照Western blot方法进行操作。

6.统计学处理：用SPSS15.0统计软件进行分析，变量以(±S)表示，采用t检验比较，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P〈0.05表示差异具有统计学意义。

结果

1. 大鼠血管钙化模型的建立：尼古丁灌胃联合维生素D3肌肉注射建立血管钙化，通过Von Kossa染色切片观察可见钙化组胸主动脉壁中层大量黑褐色至深黑色钙盐沉积，管壁僵硬，并且黑色沉积物面积与钙化程度成正比，未钙化部分呈红色。对照组切片Von Kossa染色均未见钙盐沉积。低浓度与高浓度Ghrelin组均见不同程度的钙盐沉积现象，高浓度组同一切面钙化面积及个数总体明显小于低浓度组，并且两组均明显小于钙化组，高于对照组。

图1.四组大鼠常规喂养四周后胸主动脉切片VonKossa染色结果[A. 对照组动脉壁全层未见黑色颗粒沉积；B. 钙化组VonKossa染色可见动脉壁中层见大量黑褐色团块状沉积（箭头所示）；C.低浓度Ghrelin+钙化组（L-Ghrelin）VonKossa染色可见动脉壁中层大量黑褐色块状物沉积并伴有中层破坏（箭头所示）；D高浓度Ghrelin+钙化组（H-Ghrelin）血管壁中层黑褐色沉积物团块面积（箭头所示）明显低于A和C]。

2. 血清钙离子（Ca2+）、ALP及BMP-4含量测定：ELISA法四组血清Ca2+、

ALP、BMP-4含量，其中低浓度Ghrelin+钙化组（L-Ghrelin）分别为：13.3±1.41mg/dl，117.1±18.05U/L，131.3±12.35pg/dl均分别高于高浓度Ghrelin+钙化组（H-Ghrelin）的8.5±1.29mg/dl，51.6±17.35U/L,115.6±8.46pg/dl；此外，L-Ghrelin和H-Ghrelin组血清Ca2+、ALP、BMP-4含量均明显低于钙化组（VC）,所有P值均小于0.05，差异具有统计学意义（具体见下图2）。

图2.ELISA法四组血清Ca2+、ALP、BMP-4含量（VC代表钙化组，L-Ghre代表低浓度Ghrelin+钙化组，H-Ghre代表高浓度Ghrelin+钙化组，CON代表对照组；*与L-Ghrelin相比，*P小于0.05，**P小于0.01； #与VC组相比，#P小于0.05，##P小于0.01，n=3）。

3. 相关钙化因子的表达(图3)：Western blot结果显示：钙化组（VC）中钙化相关因子(BMP-4、BMP-2、OPN)的表达均较其他三组明显升高，高浓度Ghrelin+钙化组（H-Ghre）和低浓度Ghrelin+钙化组（L-Ghre）相比钙化相关因子表达均降低且高于对照组（CON），差异均有统计学意义(P均＜0.05)。

图3.Western blot检测四组大鼠胸主动脉钙化因子BMP-2、BMP-4的表达情况。（VC代表钙化组，L-Ghrelin代表低浓度Ghrelin+钙化组，H-Ghrelin代表高浓度Ghrelin+钙化组，CON代表对照组；*与L-Ghrelin相比，*P小于0.05，**P小于0.01； #与VC组相比，#P小于0.05，##P小于0.01，n=3）

4.钙化组与对照组Ghrelin水平表达差异检测（图4）：相比对照组给予尼古丁灌胃联合维生素D3肌注的钙化组大鼠Western blot结果显示两组Ghrelin蛋白表达无明显差异（P＞0.05，无统计学意义），说明实验所用的建模方法并不会对大鼠体内Ghrelin水平产生明显影响。

图4.钙化组与对照组Ghrelin蛋白表达的Western blot检测结果。（P＞0.05，n=3）

讨论

随着社会老龄化的日益加剧，血管钙化显著增加了心血管病的发病率，因此现在也受到越来越多的关注。血管钙化是临床上比较常见的疾病，尤其在肾功能衰竭，脂质代谢异常及糖尿病血管病变的病人中更常见，既往的观点认为血管钙化是钙盐在血管壁被动沉积的过程，是钙磷代谢紊乱的结果，而炎症反应、细胞凋亡会加剧血管钙化进展^[9]。经过最近这些年的研究发现血管钙化是多因素参与的与骨细胞代谢、软骨发育相关的一个可以主动调控的过程^[10]。临床中我们发现通CT等器械检测，吸烟病人血管钙化的发病率明显高于不吸烟患者，本实验通过对大鼠给予外源性尼古丁刺激模拟了吸烟这个血管钙化危险因素，此外给予外源性维生素D3模拟体内钙盐沉积，通过VonKossa染色可以明显看到动脉中层有大量黑褐色钙盐沉积，利用Ellisa方法对血清进行检测可以看到血清钙离子、ALP、BMP-4含量明显增高。因此，本研究证实了可以通过尼古丁联合维生素D3可以成功建立大鼠血管钙化模型。

目前有关Ghrelin可以减轻钙化的研究主要是在体外建立细胞钙化模型基础上进行的，本实验建立的体内模型更加逼真的模拟了人体血管钙化的形成过程。此外，本实验采用同一批次年轻大鼠建模，避开了老龄带来的生理性血管钙化对实验的

研究发现外源性Ghrelin有减弱钙化程度的作用，但其机制目前并没有统一的公认观点，有国外研究表明Ghrelin可以通过MAPK-ERK通路减轻凋亡抑制血管钙化，但并不是唯一机制^[11-12]。Ghrelin通过GH/IGF-1轴的激活起作用,IGF-1通过减弱促凋亡因子Bax和Caspase-3抑制凋亡减轻钙化,也可以通过酰基化Ghrelin激活ERK1 / 2和PI3K / AKT来抑制细胞凋亡^[13-14]。目前，有关Ghrelin的研究尚处于起步阶段，而且目前研究仅限于体外细胞水平，Ghrelin在体内的作用机制尚不完全明确，但Ghrelin为临床上高危钙化病人治疗减轻钙化提供了一个方向。要想作为临床上的治疗手段则需要进行更广泛的探索。Ghrelin在将来有望成为治疗心血管系统疾病的重要靶点。

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