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响应曲面法优化硫酸法改性甜玉米芯多糖
马永强， 肖恩来， 王鑫 ，高爽， 张凯
（哈尔滨商业大学 食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076）
摘要：为了将提取、分级醇沉后的甜玉米芯多糖（SCP）生物活性提高，本论文采用了浓硫酸法将醇沉后的甜玉米芯多糖进行硫酸酯化修饰（SSCP），采用响应曲面法影响甜玉米芯多糖硫酸酯化取代度的3个影响因素：甜玉米芯添加量、反应时间以及硫酸铵添加量进行优化。利用Design Expert 8.0软件分析后根据实验条件优化：甜玉米性多糖硫酸酯化在甜玉米芯添加量1.0g、反应时间1.5h、硫酸铵添加量0.14g的最佳工艺条件下，硫酸酯化后的甜玉米性多糖取代度达到1.43±0.02，实测结果与响应曲面拟合得到的结果无显著差异。
关键词：甜玉米芯多糖、响应曲面、硫酸酯化
多糖在自然界分布广泛，资源丰富，具有多种生物活性，许多天然多糖均具有降血糖活性，多糖及其衍生物近年来治疗糖尿病药物的研究开发己成为一个热门领域[1]。目前报道植物多糖包括南瓜多糖、灵芝多糖、黄连多糖等，对于多糖的提取、纯化、结构等方面的研究也在不断地加深。甜玉米芯是甜玉米的副产物，常作为青储饲料，并且甜玉米芯含有较丰富的营养物质，其含有大量的多糖、多酚、粗纤维以及多种必需氨基酸等，可利用价值很高，我国每年都有大量的甜玉米芯作为燃料烧掉造成能源的浪费[2]。
天然多糖有众多的生物活性，但同时也存在着一些问题。包括天然多糖的某种活性较低或者缺乏某种活性。因此从根本上解决这些问题应该采取一定的方法对多糖结构进行适当修饰。从而提高了多糖的利用价值。目前国内报道研究的修饰方法包括硫酸酯化、羧甲基化、乙酰化、磺酰化、烷基化等。其中硫酸酯化因为其特殊的作用引起了学者们的广泛关注。多糖的硫酸酯化也为多糖带来了新的功能与活性。焦中高等人研究发现，硫酸酯化修饰降低了红枣多糖对α-淀粉酶的活性，同时对提高红枣多糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[3]。Xie等人发现从青钱柳（Cyclocarya paliurus）提取的多糖经过化学修饰以获得其硫酸化衍生物在羟基、超氧化物，DPPH自由基测定和β-胡萝卜素 - 亚油酸中表现出优异的抗氧化活性[4]。Lu等人证明硫酸酯化的牛樟芝多糖通过诱导蛋白酶体依赖性降解途径有效降低TGFR蛋白水平从而抑制肺癌细胞的活力和迁移[5]。Li等发现硫酸酯化的南瓜多糖相比于为酯化的南瓜多糖显示出更高的抗凝血活性[6]。目前文献报道的硫酸酯化方法有氯磺酸—吡啶法、SO3-吡啶法、浓硫酸法等，浓硫酸法具有温和的反应条件，制备流程简单易行，并且最终得到的取代度较高的硫酸酯化多糖。因此本文选去浓硫酸法酯化甜玉米芯多糖，通过单因素试验，响应曲面设计对制备工艺进行优化。
1.材料与方法
1.1材料与仪器
甜玉米芯（美国脆王）：FW177型、浓硫酸、正己烷、明胶、硫酸铵、硫酸钾、三氯乙酸、盐酸、氢氧化钠、正丁醇
中草药粉粹机、电热恒温鼓风干燥箱、水浴锅、恒温磁力搅拌器、紫外分光光度计、冷冻干燥器
1.2实验方法
1.2.1甜玉米芯多糖（scp）的制备
甜玉米芯 → 脱脂（正己烷）→ 提取（热水提）→ 过滤 → 上清液 → 浓缩 → 脱蛋白（Sevag法）→ 脱色（D301阴离子交换树脂）→ 醇沉（三倍体积无水乙醇醇沉）→ 冷冻干燥 → 甜玉米芯多糖[7]。
1.2.2硫酸酯化甜玉米芯多糖
在冰水浴条件下，将一定量的浓 H2SO4、正丁醇和硫酸铵，置于100 mL烧杯中于磁力搅拌器中进行反应适当时间，温度控制在0 ℃，称取适量甜玉米芯多糖，反应一定时间。用体积分数为70% 的NaOH溶液调至中性，将溶液移入透析袋，流水透析2 d，蒸馏水透析1 d，加入3 倍体积95%乙醇，充分混匀，静置过夜。继续用95%乙醇沉淀，真空冻干，得到酯化甜玉米芯多糖[8]。
1.2.3标准曲线的绘制[9]
将恒重的硫酸钾（105℃）溶解于1mol/L盐酸溶液中使其最终浓度为1mg/mL的硫酸钾标液。分别吸取一定体积的硫酸钾溶液，并用盐酸将各管补至0.2 mL，用同样体积的盐酸作为对照样，做两组平行一组、二组。向一组加入3.8mL体积分数为3 %的三氯乙酸溶液，充分摇匀，后加入1mL 质量分数0.5%的氯化钡-明胶溶液，充分震荡，在室温下静置反应20min后360nm处测定其吸光度值为A1。在二组加入3.8mL体积分数为3 %的三氯乙酸溶液，充分摇匀，后加入1mL 质量分数0.5%的明胶溶液，充分震荡，在室温下静置反应20min后360nm处测定其吸光度值为A2。以一组、二组两者吸光度的差值A1-A2为纵坐标，以硫酸根质量作为横坐标，绘制硫酸根标准曲线。
1.2.4取代度的测定
取甜玉米芯多糖硫酸酯化衍生物2mg，溶于2mL1mol/L盐酸溶液中，在100℃沸水浴条件下反应1h，吸取0.2mL进行样品分析，按照以上方法进行测定。将吸光度差值代入标准曲线计算出硫酸基的质量并根据公式计算取代度。
式中：S%为硫酸根的质量分数；WS为硫酸酯化后的甜玉米芯多糖中所含有的硫酸根的质量（mg）；W为称取甜玉米芯多糖硫酸酯化衍生物的质量；DS为甜玉米芯多糖硫酸酯化衍生物取代度。
1.2.5硫酸酯化甜玉米芯多糖的制备工艺单因素实验
选取甜玉米芯多糖添加量、反应时间和硫酸铵量添加量对酯化的甜玉米芯取代度影响进行研究，单因素设置如表 1 所示。
表1硫酸酯化甜玉米芯多糖的制备单因素设置
Table 1 Preparation of sulfated sweet corncob polysaccharides
|
编号 |
甜玉米芯多糖添加量（g） |
反应时间（h） |
硫酸铵添加量（g） |
|
1 |
0.3 |
0.5 |
0.05 |
|
2 |
0.6 |
1.0 |
0.10 |
|
3 |
0.9 |
1.5 |
0.15 |
|
4 |
1.2 |
2.0 |
0.20 |
|
5 |
1.5 |
2.5 |
0.25 |
1.2.5.1甜玉米芯多糖添加量单因素试验
在冰水浴条件下，将浓 H2SO4：正丁醇=1：3和0.20g硫酸铵，置于100 m L烧杯中于磁力搅拌器中进行反应30min，温度控制在0 ℃，称取甜玉米芯多糖（0.3、0.6、0.9、1.2、1.5g），反应1h后。用体积分数为70% 的NaOH溶液调至中性，经过透析，醇沉，真空冻干，得到酯化甜玉米芯多糖，按照公式（1）、（2）计算取代度。
1.2.5.2反应时间单因素试验
在冰水浴条件下，将浓 H2SO4：正丁醇=1：3和0.2g硫酸铵，置于100 mL烧杯中于磁力搅拌器中进行反应30min，温度控制在0 ℃，称取甜玉米芯多糖0.9g，反应一段时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h）后。用体积分数为70% 的NaOH溶液调至中性，经过透析，醇沉，真空冻干，得到酯化甜玉米芯多糖，按照公式（1）、（2）计算取代度。
1.2.5.3硫酸铵添加量单因素试验
在冰水浴条件下，将浓 H2SO4：正丁醇=1：3和硫酸铵（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25g），置于100 m L烧杯中于磁力搅拌器中进行反应30min，温度控制在0 ℃，称取甜玉米芯多糖0.9g，反应1.5h后。用体积分数为70% 的NaOH溶液调至中性，经过透析，醇沉，真空冻干，得到酯化甜玉米芯多糖，按照公式（1）、（2）计算取代度。
1.2.6响应面设计
通过单因素试验的水平范围，应用Design-Expert 8.0软件，设计三因素三水平响应曲面试验，利用响应曲面试验结果，硫酸酯化甜玉米芯多糖最优工艺条件，响应面试验因素水平见表1。
通过单因素试验的水平范围，应用Design-Expert 8.0软件，采用Box-Behnken设计（BBD）。选择甜玉米芯多糖添加量（X1），反应时间（X2）和硫酸铵添加量（X3）三个因素三水平的响应曲面设计，以取代度作为响应值。 对硫酸酯化甜玉米芯多糖的制备工艺进行优化。试验分析因素及水平如表2所示。
表2响应面因素分析水平表
Table 2 Response surface factor analysis level table
|
编码 |
参数名称 |
-1 |
0 |
1 |
|
X1 |
甜玉米芯多糖添加（g） |
0.6 |
0.9 |
1.2 |
|
X2 |
反应时间（h） |
1.0 |
1.5 |
2.0 |
|
X3 |
硫酸铵添加量（g） |
0.10 |
0.15 |
0.20 |
2.结果与讨论
2.1硫酸基含量标准曲线的绘制
图1 硫酸基含量测定标准曲线
Fig. 1 The standard curve for sulfate content
在硫酸钾最大吸收波长360nm下测得各浓度标准硫酸钾溶液的吸光度值得出标准曲线，如图1，得到回归方程为：y=0.0039x-0.001(R2=0.9992)，由R2可知该回归方程线性显著，其有效线性范围为0~24μg/mL。
2.2单因素结果及分析
SSCP是硫酸化修饰将硫酸根将甜玉米芯多糖大分子链当中单糖分子上的其中一个或几个羟基取代而产生的甜玉米芯多糖衍生类物质。本实验利用浓硫酸法制备硫酸酯化的甜玉米芯多糖。因此，本研究对甜玉米芯添加量、反应时间及硫酸铵添加量对酯化甜玉米芯堆糖的取代度进行检测。
图2 甜玉米芯多糖添加量对甜玉米芯多糖硫酸酯化修饰的影响
Fig.2 Effects of the addition of polysaccharides from sweet corncob on sulfation of polysaccharides from sweet corncob
由图2可知取代度随着甜玉米芯多糖的添加量增大而增加。当其添加量为0.9g 的时候，取代度出现最大值0.92±0.01，随后继续增加甜玉米芯多糖的添加量取代度急剧降低。这是因为甜玉米芯多糖添加量过低时，会发生碳化；而甜玉米芯多糖添加量过高时，甜玉米芯多糖不能完全酯化，因此最佳甜玉米芯添加量为0.9g[10]。
图3 反应时间对甜玉米芯多糖硫酸酯化修饰的影响
Fig. 3 Effects of reaction time on sulfation of polysaccharides from sweet corncob
由图3可知取代度随着反应时间的增大而增加。当反应时间为1.5h的时候取代度出现最大值1.31±0.02，随后继续增加反应时间取代度变化较迅速降低，并在此后呈现降低的趋势。因此选取反应时间为1.5h进行优化实验。
图4 硫酸铵添加量对甜玉米芯多糖硫酸酯化修饰的影响
Fig. 4 Effect of Ammonium Sulfate Addition on Sulfation Modification of polysaccharides from sweet corncob
由图4可知取代度随着硫酸铵添加量的增大而增加。当硫酸铵添加量为0.15g的时候取代度出现最大值1.22±0.02，随后继续增加硫酸铵添加量取代度变化较为缓慢，并在此后呈现降低的趋势。因此选取硫酸铵添加量为0.15g进行优化实验。
通过分析可得，浓硫酸法酯化甜玉米芯多糖的较优条件为甜玉米芯多糖添加量为0.90g、硫酸铵添加量0.15g、反应时间为1.5h。
2.3响应面法优化硫酸酯化甜玉米芯多糖制备工艺结果及分析
采用多元回归分析，拟合二次多项式回归模型的 Box-Behnken 实验设计及数据结果，通过此软件共设计了17 组实验。根据实验设计进行实验，所得结果见下表3。
表3响应面分析结果
Table 3 Design and result of response surface experiments
|
试验号 |
X1(g) |
X2(h) |
X3(g) |
取代度 |
|
1 |
1 |
0 |
1 |
0.82 |
|
2 |
0 |
0 |
0 |
1.40 |
|
3 |
-1 |
-1 |
0 |
0.91 |
|
4 |
0 |
1 |
-1 |
1.15 |
|
5 |
0 |
0 |
0 |
1.45 |
|
6 |
-1 |
0 |
1 |
1.04 |
|
7 |
0 |
-1 |
-1 |
1.08 |
|
8 |
0 |
-1 |
1 |
1.01 |
|
9 |
-1 |
1 |
0 |
1.13 |
|
10 |
0 |
0 |
0 |
1.43 |
|
11 |
-1 |
0 |
-1 |
0.92 |
|
12 |
1 |
1 |
0 |
0.88 |
|
13 |
0 |
0 |
0 |
1.39 |
|
14 |
0 |
0 |
0 |
1.44 |
|
15 |
1 |
0 |
-1 |
0.81 |
|
16 |
0 |
1 |
1 |
1.28 |
|
17 |
1 |
-1 |
0 |
0.78 |
X1:甜玉米芯多糖添加量，X2:反应时间，X3:硫酸铵添加量
对设计方案中17 组实验数据，运用Design-Expert 软件进行多元回归拟合，得到以取代度Y 为响应值，X1、X2、X3 为自变量的二次多项回归方程，回归方程如下：
Y=1.42+0.082X1+0.024X2-0.089X3+0.050 X1 X2-0.030 X1 X3-0.027 X2 X3-0.13 X12-0.16X22-0.36 X32
表4回归模型方差分析表
Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for the regression model
|
Source |
Sum of squares |
df |
Mean of squares |
F value |
p-value Prod＞F |
|
Model
|
