肿瘤患者、脑卒中患者、正常人三种样本DNA产量比较研究

 秦肖， 侯菲 魏伟 ，耿嘉正（济宁医学院，山东 济宁 272067）

摘要：目的：白细胞数目在肿瘤患者和脑卒中患者中的不同意义  方法：按照天根血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作  结果：与正常健康人群比较肿瘤患者的基因组DNA提取量较低，脑卒中患者的基因组DNA提取量最高；女性的基因组DNA提取量高于男性的基因组DNA提取量；年轻人的基因组大拿DNA提取量高于年老长者的基因组DNA提取量  结论：通过DNA提取分析表明，不同的病症DNA提取产量具有一定的差异性

关键词：白细胞；肿瘤患者；脑卒中患者

随着疾病的发展，在疾病的不同阶段白细胞都占据着一席之地，并且对不同的疾病有着不同的意义。例如，白细胞在肿瘤患者中可以抑制肿瘤，预防免疫逃避和疾病的进程^{[1, 2]}，并且免疫功能低下也是肿瘤患者治疗失败的一个重要因素^[3]；在脑卒中患者中，白细胞不仅对大脑有损伤，还是预后感染的主要因素^[4]，白细胞增多，脑卒中患者的病情就会加重^[5] ，也反映着机体的炎症状态^[6]。因此，白细胞在不同疾病中扮演着不同的角色。

由于大部分DNA来自于白细胞，因此DNA产量在一定程度上反应着白细胞的含量。提取血液中的DNA，成为判断患者疾病状态的一个重要因素。通过提取不疾病、性别、年龄的样本，根据DNA产量的不同，推测出DNA产量应于疾病具有一定的相关性，不同疾病患者的DNA产量不同也具有不同的临床意义。本实验通过提取不同样本的DNA，得出DNA产量对疾病有着重要的临床意义。

1.实验

1.1实验方法

按照天根血液基因组DNA提取试剂盒（PD348）说明书进行操作。

1.2操作步骤

使用前先在漂洗液PWB中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签。

1.2.1处理血液样品(本产品适用于处理100ul-1ml血液样品)

取500ul白膜层样本，在样品中加入2倍血液样品体积的细胞裂解液CL,颠倒混匀,10000rpm离心1min,吸去上清,留下细胞核沉淀淀,向细胞核沉淀中加200ul缓冲液GS,振荡至彻底混匀。

1.2.2加入200ul缓冲液GB和50ul Proteinase K的预混溶液至上述处理获得的200ul样品中,充分颠倒混匀,56℃放置10min,其间颠倒混匀数次,溶液应变清亮(如溶液未彻底变清亮,请延长裂解时间至溶液清亮为止)。如果未清亮加热时间延长至清亮。

1.2.3室温放置2-5min后加入350ul缓冲液BD,充分颠倒混匀,此时可能会出现絮状沉淀。

1.2.4将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入ー个吸附柱CG2中(吸附柱CG2放入收集管中),12000rpm离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CG2放入收集管中。

1.2.5向吸附柱CG2中加入500ul缓冲液GDB,12000pm离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CG2放入收集管中。

1.2.6向吸附柱CG2中加入600ul漂洗液PWB(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CG2放入收集管中。

1.2.7重复操作步骤6。

1.2.8 12000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱CG2置于室温放置2min,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

1.2.9将吸附柱CG2转入1.5ml离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加100ul洗脱缓冲液TB,室温放置2min,12000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中。

1.3 测试

取收集管中的溶液1ul，用NANODROP 2000C测量DNA浓度。

测试结果均在(A260/A280比值均在1.7-2)

1.4实验结果

分别取正常人样本10例，编号为1-10；肿瘤患者样本10例，编号为11-20 ；脑卒中患者样本10例，编号为21-30，其数据分析结果见下表1，图2。

表1三种样本基因组DNA提取量对比表

图2三种样本基因组DNA提取量对比图

由表1，图2可以看出，肿瘤患者的基因组DNA提取量低于正常人的基因组DNA提取量；脑卒中患者的基因组DNA提取量高于正常人的基因组DNA提取量。

1.2根据年龄的不同，分别取正常人样本30例，编号为31-60；肿瘤患者样本10例，编号为61-70；脑卒中患者样本48例，编号为71-118；其数据分析结果见下表3，表4，图5，表6，图7。

表3三种样本基本信息表

表4年龄段基因组DNA提取量对比表

图5 三种样本年龄段基因组DNA提取量对比图

由表4，图5可以看出，年轻人患者的基因组DNA提取量高于老年人患者的基因组DNA提取量。

表6性别基因组DNA提取量对比表

图7三种样本性别基因组DNA提取量对比图

由表6，图7可以看出，女性患者的基因组DNA提取量高于男性患者的基因组DNA提取量。

2.讨论

本试验通过对不同年龄段、性别、疾病的对比，表明了年轻人的DNA产量高于年长者的DNA产量，女性的DNA产量高于男性的DNA产量，肿瘤患者的DNA产量最少。白细胞又被称作免疫细胞，体现着机体的免疫系统的状况。免疫系统对于机体有着不可或缺的地位，了解免疫系统的状况对于患者来说非常有意义。因为DNA来自于血液中的白细胞，而在不同的疾病中，白细胞对患者来说也有着不同的作用。对于肿瘤患者来说，患者的发病和进展有着重要的作用^[7][7]。虽然白细胞是免疫系统的关键细胞，但是已经可以通过白血球药物对其进行优化和获取，这也有助于肿瘤患者的治疗^[8][8]。但是对于脑卒中患者来说，机体中含有大量的白细胞则会对患者有着严重的影响，危及着患者的生命安全。当脑卒中发生时，白细胞具有降低脑血流量，参与损害脑实质，以及损害血脑屏障的作用^[9][9]，这些因素都对患者的生命造成了严重的威胁。所以，我们根据此实验得出DNA的产量对不同疾病有着不同的作用，也反映着疾病的发展趋势。

本文通过对不同年龄、性别、疾病的DNA产量进行对比，得出其对于肿瘤患者和脑卒中患者具有不同意义。因此，我们根据DNA产量的多少来判断不同疾病的严重性，并推断疾病的后期发展。

参考文献

［1］Netea-Maier, R.T., J.W.A. Smit, and M.G. Netea, Metabolic changes in tumor cells and tumor-associated macrophages: A mutual relationship. Cancer Lett, 2018. 413: p. 102-109.

［2］Monjazeb, A.M., et al., Immunoediting and antigen loss: overcoming the achilles heel of immunotherapy with antigen non-specific therapies. Front Oncol, 2013. 3: p. 197.

［3］Janicka, M. and J. Gubernator, Use of nanotechnology for improved pharmacokinetics and activity of immunogenic cell death inducers used in cancer chemotherapy. Expert Opin Drug Deliv, 2017. 14(9): p. 1059-1075.

［4］Garcia-Culebras, A., et al., Myeloid cells as therapeutic targets in neuroinflammation after stroke: Specific roles of neutrophils and neutrophil-platelet interactions. J Cereb Blood Flow Metab, 2018: p. 271678X18795789.

［5］Tian, C., et al., Association of lower leukocyte count before thrombolysis with early neurological improvement in acute ischemic stroke patients. J Clin Neurosci, 2018.

［6］Ritzel, R.M., et al., Aging alters the immunological response to ischemic stroke. Acta Neuropathol, 2018. 136(1): p. 89-110.

［7］Chen, Y., et al., Improved Cancer Immunochemotherapy via Optimal Co-delivery of Chemotherapeutic and Immunomodulatory Agents. Mol Pharm, 2018.

［8］He, H., et al., Leutusome: A biomimetic nanoplatform integrating plasma membrane components of leukocytes and tumor cells for remarkably enhanced solid tumor homing. Nano Lett, 2018.

［9］Benakis, C., G. Llovera, and A. Liesz, The meningeal and choroidal infiltration routes for leukocytes in stroke. Ther Adv Neurol Disord, 2018. 11: p. 1756286418783708.