芦丁缓解脑损伤并改善D-半乳糖诱导小鼠衰老的认知功能

石茜，何守玉,徐永强,王翔

（湖州市第一人民医院、湖州师范学院附属第一医院，浙江 湖州 313000 ）

Qian Shi, Shoiuyu He, Yongqiang Xu, Xiang Wang

（First People's Hospital of Huzhou, First Affiliated Hospital of Huzhou University, Huzhou 313000, China）

摘要：目的  研究芦丁对D-半乳糖（D-gal）诱导小鼠神经毒性的保护作用机制。方法  D-gal诱导小鼠 “衰老”模型，同时给予芦丁口服6周。使用莫里斯水迷宫（MWM）评估衰老小鼠的空间学习和记忆能力，试剂盒检测海马组织总超氧化物歧化酶（T-SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和一氧化氮合酶（NOS）活性以及丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）水平。用甲酚紫染色或用微管相关蛋白-2（MAP-2），半胱天冬酶-3和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体标记脑的冠状切片。结果  芦丁显著降低了D-gal处理小鼠的逃避潜伏期和游泳距离，恢复了衰老小鼠脑海马中T-SOD，GSH-Px和NOS的异常活性，降低了海马MDA和NO水平。此外，芦丁可防止D-gal处理的小鼠海马中的神经元丢失，树突损伤和神经元凋亡，并且还抑制由D-gal刺激的星形细胞活化。结论  芦丁能缓解脑损伤，改善D-gal诱导的小鼠老化过程中的认知功能，在脑老化过程中可能有正效应。

关键词：芦丁；d半乳糖；老化；神经保护；认知功能

Abstract: Objective To study the protective mechanism of rutin on D-galactose (D-gal)-induced neurotoxicity in mice. Methods  D-gal induced a "aging" model in mice. At the same time given rutin for 6 weeks. The Morris water maze (MWM) was used to assess spatial learning and memory in aging mice. The kit detects total superoxide dismutase (T-SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and Nitric oxide synthase (NOS) activity and malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) levels. Coronal sections of the brain were labeled with cresyl violet or with microtubule-associated protein-2 (MAP-2), caspase-3 and glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibodies. Results Rutin significantly reduced the escape latency and swimming distance of D-gal treated mice, restored the abnormal activities of T-SOD, GSH-Px and NOS in the hippocampus of aging mice, and decreased the levels of MDA and NO in hippocampus. In addition, rutin prevents neuronal loss, dendritic damage and neuronal apoptosis in hippocampus of D-gal treated mouse, and also inhibits astrocyte activation stimulated by D-gal. Conclusion Rutin can alleviate brain damage and improve the cognitive function of D-gal-induced mouse aging. It may have a positive effect during brain aging.

Key words:  rutin; d galactose; aging; neuroprotection; cognitive function

衰老是一个渐进缓慢的过程，随着时间的推移细胞生理过程被改变，并导致几种与年龄相关的疾病，如阿尔茨海默病，帕金森病和亨廷顿舞蹈病。据报道，活性氧（ROS）产生与抗氧化酶活性之间的不平衡导致的氧化损伤在衰老过程中起关键作用。活性氧的过量产生或抗氧化剂的减少可引起脂质过氧化，DNA损伤和蛋白质氧化，最终影响生物体的正常功能[1]。

芦丁（图1）是许多传统中草药中常见的黄酮类化合物，由于其显著的抗氧化特性，已经展现出广泛的药理学应用。大量研究显示芦丁能逆转内源性抗氧化酶GSH-Px，谷胱甘肽还原酶（GR），过氧化氢酶（CAT）和SOD等活性，导致ROS和MDA形成减少[2-4]。此外，芦丁还具有一定的抗炎活性，通过减少环氧化酶-2，GFAP，白细胞介素-8，NOS，核因子-κB的表达和阻止海马形态学改变来减轻STZ诱导的炎症[5]。近年来，芦丁在神经方面的保护作用已越来越受到关注。已证明芦丁是治疗脑缺血的有效药物。在大脑中动脉阻塞之前口服芦丁21天，梗塞面积显著减少，神经系统缺陷减少[6]。此外，也有研究显示，芦丁可能对6-OHDA诱导的PD样和A-β42诱导的AD样损伤具有保护作用[7]。但芦丁在衰老引起的认知功能下降中的作用和机制很少有报道。 D-gal是人体内的还原糖，当其含量高于正常水平时，它可被半乳糖氧化酶氧化成醛和过氧化氢。有研究证明D-gal处理的动物可出现衰老相关的变化，包括空间学习和记忆的损害 [8]。因此，在本研究中，我们利用D-gal诱导的小鼠衰老模型，研究口服芦丁后对衰老模型小鼠认知功能的作用及相关机制，以期为衰老引起的认知功能障碍提供新的治疗和预防思路。

图1 芦丁结构

Fig. 1. Structure of rutin.

1. 材料和方法

1.1 试剂  芦丁和D-gal购自美国Sigma公司。T-SOD，MDA，GSH-Px，NO，NOS的试剂盒购自南京建成生物工程研究所。多克隆兔抗切割的Caspase-3抗体购自美国的细胞信号技术公司（Cell Signaling Technology，Inc.，U.S.A）。多克隆兔抗MAP-2抗体和小鼠抗GFAP抗体购自德国的密理博公司（Millipore，Inc.，Germany）。

1.2 动物和药物处理  雄性ICR小鼠18-22 g，购自南通大学实验动物中心（南通，中国）。实验前，这些动物适应本实验室环境1周。安置于标准条件下（25℃，12 h光照，12 h黑暗），并且在实验期间允许自由获得食物和水。所有流程均按南通大学动物保护与利用委员会和江苏省动物保护伦理委员会批准（批准文号：SYXK（SU）2007- 0021）。

1.2.1 动物分组及模型构建 将小鼠随机分成4组（每组20只小鼠）。对照组接受每日皮下（s.c.）注射不含芦丁口服的盐水（0.9％NaCl）和0.5％羧甲基纤维素钠溶液。 2-4组小鼠每天接受100 mg·kg^-1的剂量皮下注射D-gal 6周。同时，D-gal处理的小鼠第2组每天口服接受0.5％羧甲基纤维素钠溶液。第3组小鼠每天口服含25mg·kg^-1的含芦丁0.5％羧甲基纤维素钠悬浮液6周，第4组小鼠每天口服含25mg· kg^-1的含维生素E 0.5％羧甲基纤维素钠悬液6周。

1.2.2  Morris 水迷宫（MWM）测试  经过6周的治疗后，MWM中进行了评估所有小鼠的空间学习能力[18]。该装置由长73cm，宽42cm，深20cm的黑色有机玻璃矩形罐组成。容器包括一个起点，一个终端平台和四个无平台设施。平台附近有一个梯子可供休息，这是安全区域。在迷宫中填充水深12厘米，温度控制在22±1℃。在训练的第一天，让每只老鼠停留在终端平台上30s以识别该位置，并将其放置在面对泳池墙的水中，在第一个起始点包含无平台设施。记录每次试验找到终端平台的逃生潜伏期。如果在2min内找不到梯子，游泳时间被定为2min，然后被引导到梯子并且在那里休息30s。小鼠每天连续6天接受试验。对于所有的试验，通过计算机化的视频成像分析系统（中国医学科学院材料医学研究所）测量并计算6天内所有小鼠的逃避潜伏期，游泳距离和游泳路径。

1.2.3  生化评估  在最后一次行为测试后24h进行生化测试。每组16只小鼠通过断头处死。小心地去除大脑并用冰冷的等渗盐水冲洗。海马在冷生理盐水中制备成10％（w / v）匀浆，用于测定T-SOD，GSH-Px和NOS活性以及MDA和NO含量。所有检查均按说明进行。

1.3 组织学和免疫荧光

在最后一次行为测试后，将每组4只小鼠用过量10％水合氯醛（腹膜内）麻醉，脑部准备用于组织学研究。小心取出脑，含4％多聚甲醛0.1M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）迅速固定。冷冻切片机在顶叶皮层和背侧海马处冠状切成25μm厚度切片。将第一组切片固定在聚赖氨酸包被的显微镜载玻片上并用1％甲酚紫染色。根据先前在我们实验室建立的方案，第二组切片用免疫荧光或免疫细胞化学标记。利用含3％ H₂O₂ PBS (0.01M) 处理并用20％山羊阻断血清温育，4℃孵育过夜，一抗为：兔MAP-2抗体（Millipore，1：200，USA）抗Caspase-3抗体（Bioworld，1：200，USA）和鼠抗GFAP抗体（Millipore，1：600，USA）。对于MAP-2标记，将切片在四乙基若丹明异硫氰酸酯（TRITC）偶联的羊抗兔IgG（H + L）中孵育（Bioworld，1：200，U.S.A）；对于caspase-3和GFAP标记，切片用羊抗鼠polink-2加聚合物（中山金桥，中国北京）温育。用计算机图像分析系统拍摄海马CA1和顶叶皮层的照片（Leica DM4000B显微镜，德国）。

1.4 尼氏染色 

计算海马CA1区域中阳性细胞的数量（0.27 mm²）。对于Caspase-3和GFAP免疫染色，我们计算海马中阳性细胞的数量（Caspase-3为0.07mm²，GFAP为0.27mm²）。所有测量均在至少3个脑切片上双侧进行，对每个动物每个面积的6个值进行平均，并将该平均值用于进一步的统计分析。这些图像均通过计算机图像分析系统（ImagePro Plus软件6.0，美国Media Cybernetics）进行量化。

1.5 统计分析  

实验数据以Mean ± S.E.M表示，P <0.05为统计学有差异。 统计学分析利用Graph pad 5.0软件，通过单因素方差进行分析， SigmaStat 2.0（SYSTAT Software Inc，USA）软件进行Dunnett检验。

2. 结果

2.1 芦丁减轻D-gal诱导的衰老小鼠的学习和记忆障碍

芦丁伺服D-gal诱导的“衰老”小鼠，MWM法测试训练试验中的小鼠逃避潜伏期和游泳路线长度以观察小鼠学习和记忆障碍的变化。如图2A和B所示，在六个训练日期间，寻找平台和游泳距离的平均逃避潜伏期逐渐下降。而D-gal处理小鼠第5天时学习能力比对照训练小鼠差（第5天，p <0.05;第6天，p <0.01）。这些结果揭示了D-gal能明显诱导小鼠的认知障碍。试验第五天开始（第5天，p <0.05;第6天，p <0.05），芦丁治疗的小鼠的表现优于D-gal处理的小鼠。同时，口服维生素E在第五至第六天达到与训练试验小鼠相似的效果。图2C显示了第二和第六天试验中小鼠的代表性泳道。

图2  MWM实验检测实验各组小鼠认知功能

Fig. 2. The MWM test of mice treated with vehicle(n = 20), D-gal (100 mg/kg, n = 20), D-gal + rutin (25 mg/kg, n = 20), D-gal + vitamin E (25 mg/kg, n = 20), respectively. (A) Latencies to find a hidden platform in the water maze during six consecutive days training. (B) The swimming distance of mice in training trials. (C) Representative swim paths of mice in the trial of the second and the sixth days. Data are presented as means±S.E.M. ^*p < 0.05 and ^**p < 0.01 versus the control mice; ^#p < 0.05 versus the D-gal-treated mice. Data were analyzed with ANOVA followed by Duncan’s multiple range test.

2.2  芦丁保护D-gal诱导的衰老小鼠的海马中的神经元

D-gal处理的小鼠脑组织切片甲酚紫染色显示海马CA1区有显著损伤并伴神经元丢失（图3B和E）。而对照小鼠的大脑没有显示出任何形态学改变（图3A和E），芦丁和维生素E处理的小鼠海马CA1显示轻度损伤（图3C，D和E）。

与对照相比（p <0.001），caspase-3的免疫组织化学显示D-gal处理的小鼠中海马凋亡阳性细胞明显增加（图4）。而芦丁和维生素E可抑制D-gal诱导的衰老小鼠海马细胞凋亡（分别为p <0.01和p <0.05）。

图3  尼式染色鼠脑组织

Fig. 3. Nissl staining of the brain tissue of mice. (A) Representative images of the vehicle control; (B) Representative images of the D-gal-treated mice; (C) Representative images of the D-gal-rutin-treated mice; (D) Representative images of the D-gal-vitamin E-treated mice. (E) Number of neurons in CA1 area of the hippocampus (n = 4). Normal neurons were counted in 1 mm-length of CA1 area under microscope (400). All values are expressed as means±S.E.M. ^**p < 0.01 versus the control mice; ^#p < 0.05 versus the D-gal-treated mice. Data were analyzed with ANOVA followed by Duncan’s multiple range test.

图4 鼠海马区caspase-3免疫荧光染色

Fig. 4. Immunohistochemistry tests of caspase-3 in hippocampus in mice. (A) Representative images of the vehicle control; (B) Representative images of the D-gal-treated mice; (C) Representative images of the D-gal-rutin-treated mice; (D) Representative images of the D-gal-vitamin E-treated mice. (E) Number of Caspase-3 positive cells in CA1 area of the hippocampus (n = 4). Data are presented as means ± SEM. ^***p < 0.01 versus the control mice; ^#p < 0.05 and ^##p < 0.05 versus the D-gal-treated mice. Data were analyzed with ANOVA followed by Duncan’s multiple range test. Black arrows represent caspase-3 positive cells.

2.3 芦丁维持D-gal诱导衰老小鼠的树突完整性

MAP-2被认为是脑损伤的敏感标记，反映了神经树突分支，重塑和可塑性。每组小鼠的脑切片用MAP-2抗体染色以检测海马CA1和顶叶皮质中的神经元结构变化，特别是树突完整性。如图5（A-H）所示，与载体对照组相比，D-gal处理的小鼠的顶叶皮质和海马CA1神经元的树突变短且丢失，而载体对照组显示出垂直、有序和整合的状态。然而，在用芦丁或维生素E处理的组中未检测到类似的破坏。

图5 MAP-2标记在顶叶皮质和海马中树突。

Fig. 5. MAP-2 labeled dendrites in parietal cortex and hippocampus. Panel A-D represents parietal cortex and panel E-H represents hippocampus. Panel A & E: Representative images of the vehicle control; Panel B & F: Representative images of the D-gal-treated mice; Panel C & G: Representative images of the D-gal-rutin-treated mice; Panel D &H: Representative images of the D-gal-vitamin E-treated mice.

2.4 芦丁在D-gal诱导衰老小鼠海马中的抗氧化作用

为了解芦丁的神经保护作用机制，我们测定了各组小鼠海马中T-SOD，GSH-Px活性及MDA含量。与对照组相比，D-gal处理组（表1）中MDA（作为度量细胞或组织的氧化应激状态的脂质过氧化产物）的含量显著增加（p <0.05）。相反，D-gal处理的小鼠海马中增加的MDA水平可被芦丁和维生素E逆转减低（p <0.05）。上述结果表明芦丁可防止衰老相关的氧化应激。此外，与对照小鼠相比，给予小鼠口服D-gal 6周显著降低了海马中T-SOD和GSH-Px的活性（T-SOD，P <0.001; GSH-Px，P <0.01）。而芦丁处理组恢复了T-SOD和GSH-Px活性（T-SOD，P <0.05; GSH-Px，P <0.05）；维生素E处理组恢复了T-SOD活性（P <0.01），但对降低的GSH-Px活性没有产生任何明显影响。

表1 芦丁对D-gal诱导衰老小鼠海马中T-SOD, GSH-Px 和MDA 水平的影响。

Table. 1. Effect of rutin on the activity of T-SOD, GSH-Px and MDA levels in the hippocampus of aging mice induced by D-gal.

Data were expressed as mean ± S.E.M (n = 8). Data were analyzed with ANOVA followed by Duncan’s multiple range test. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 versus the control mice; # p < 0.05 and ## p < 0.01 versus the D-gal-treated mice.

2.5 芦丁对D-gal诱导衰老小鼠海马NO水平和NOS活性的影响

如图6所示，与载体对照小鼠相比，D-gal处理的小鼠海马中的总NO水平和NOS活性明显增加（P <0.001）。而芦丁明显降低了NO水平，抑制了NOS活性（P <0.001，P <0.01）。维生素E与芦丁对D-gal诱导的衰老小鼠NO水平和NOS活性具有相似的抑制效应（P <0.05）。

图6 芦丁对鼠海马区NO和NOS的影响

Fig. 6. Effect of rutin on the changes of NO level and NOS activity in the hippocampus of mice. (A) NO level in the hippocampus; (B) NOS activity in the hippocampus. Data are presented as means±S.E.M. (n = 8). ^***p < 0.001 versus the control mice; ^#p < 0.05, ^##p < 0.01 and ^###p < 0.01 versus the D-gal-treated mice. Data were analyzed with ANOVA followed by Duncan’ s multiple range test.

2.6 芦丁抑制D-gal诱导的衰老小鼠海马中的星形细胞活化

据报道，长期注射D-gal后星形胶质细胞的损伤与氧化应激诱导的脑衰老有关[19]。广泛用于标记星形胶质细胞激活的标志物是中间丝GFAP，它在活化的星形胶质细胞中累积 [20]。如图7所示，相对于载体对照，D-gal处理的小鼠中海马活化的星形胶质细胞的GFAP信号强（P <0.01），但芦丁处理组中通常较低（P <0.05）。同时，维生素E对星形胶质细胞活化无明显影响。

图7 芦丁激活鼠脑海马区星状细胞

Fig. 7. Activated astrocytes in the hippocampus of mice. (A) Representative images of the vehicle control; (B) Representative images of the D-gal-treated mice; (C) Representative images of the D-gal-rutin-treated mice; (D) Representative images of the D-gal-vitamin E-treated mice. (E) Number of GFAP positive cells in CA1 area of the hippocampus (n = 4). All values are expressed as means±S.E.M. ^**p < 0.01 versus the control mice; ^#p < 0.05 versus the D-gal-treated mice. Data were analyzed with ANOVA followed by Duncan’s multiple range test.

3. 讨论

芦丁对神经保护的作用已被大量研究报道，其在认知功能上的良好效果也逐渐被人们所了解，由于芦丁和/或其代谢物有穿过血脑屏障的能力，它被证明可以改变认知以及神经退行性疾病的各种行为症状，对阿尔兹海默病具有一定的治疗潜力[9]。此外，也有研究证明芦丁对1型糖尿病引起的认知功能障碍也有缓解作用[10]，然而，芦丁在衰老引起的认知功能减退中的作用很少有报道。由于D-gal可模拟人脑老化过程 [11]， MWM主要用于空间学习和参考记忆测试，因此本研究中，我们使用MWM测试了小鼠的认知能力。验证了D-gal 100mg / kg剂量6周后，其MWM性能显著下降的作用，长期口服芦丁的D-gal处理小鼠显著降低逃避潜伏期和缩短游到平台的距离，这表明芦丁具有改善由D-gal诱导的认知缺陷的潜力。此外，作为抗氧化剂的金标准，维生素E在D-gal诱导衰老小鼠中表现出与芦丁相似的保护作用。

我们的研究也明确地证明芦丁可以抑制神经元丢失，抑制海马神经元细胞的凋亡，从而提高D-gal处理小鼠的空间学习和记忆能力。Caspase-3是细胞凋亡的主要标志物，可被用作脑损伤的一项指标[12]，尼式染色显示芦丁对海马神经元的有益作用，保护D-gal诱导的海马神经元丢失和细胞凋亡。有报道显示， D-gal处理的脑组织中乙酰胆碱转移酶（ChAT）显著降低[13]。由于ChAT在神经元体内合成并通过轴突和树突运输至突触囊泡，所以轴突和树突的完整性对于ChAT运输是重要的。在这项研究中，我们检测了MAP-2的表达以观察含或不含芦丁的D-gal处理的小鼠中的树突变化。我们发现在D-gal处理的小鼠的顶叶皮层和海马区域中MAP-2阳性树突具有显著的损伤。芦丁处理后，树突比D-gal处理的小鼠更加完整，并且这种树突完整性可能在中枢胆碱能系统和认知功能中起重要作用。  

根据衰老的自由基理论，正常代谢生物氧化副产物ROS能导致大分子的氧化损伤，并随着年龄增长引起细胞功能障碍并最终导致细胞死亡。在本研究中，我们观察到D-gal引起小鼠的海马中T-SOD和GSH-Px内源抗氧化酶活性的显著失活，MDA含量增加。而芦丁能提高D-gal诱导的衰老小鼠的抗氧化能力，这与其他报道一致[14]。这些发现表明芦丁在一定程度上通过改善抗氧化防御系统的活性来消除因D-gal引起的ROS超载。

星形细胞足突，作为血脑屏障的组成部分，在维持脑微环境的稳态中发挥重要作用。因此，星形胶质细胞是血流中ROS的第一道防线，其结构和功能改变可影响“神经胶质小体”的完整性并导致严重后果。受D-gal诱导的持续氧化应激的影响，星形胶质细胞的结构和功能被破坏，这些受损的星形胶质细胞可能会降低其抗氧化能力，并通过上调iNOS表达而产生NO。从星形胶质细胞释放的大量NO是神经毒性的，它通过多种信号途径导致神经元损伤，在此基础上，星形胶质细胞衍生的NO可能在这种衰老模型的发病机制中起关键作用[15]。在本研究中，D-gal处理的小鼠中血管周围星形细胞足突肿胀，NOS活性和NO水平增加。然而，芦丁或维生素E的长期治疗逆转了D-gal引起的NOS活性和NO水平的升高，表明芦丁对脑损伤的保护作用可能与氧化应激的减弱有关。

总之，这项研究的结果表明， D-gal诱导的模拟衰老和认知功能障碍与氧化应激的增加和由此引发的凋亡级联导致的海马神经元的损伤相关。芦丁通过增强认知能力，改善抗氧化防御系统的活性，抑制神经细胞凋亡，保持树突完整性和抑制星形胶质细胞激活发挥明显的神经保护作用。虽然确切的潜在机制仍不清楚，但本研究结果表明芦丁可能在脑老化期间具有积极作用。

参考文献：

1.     Lovell S et al. Sociocultural barriers to cervical screening in South Auckland[J]. New Zealand. Soc Sci Med 2007; 65: 138-50.

2 Khan MM et al. Rutin protects dopaminergic neurons from oxidative stress in an animal model of Parkinson's disease[J]. Neurotox Res 2012; 22: 1-15.

3 Magalingam KB et al. Rutin, a bioflavonoid antioxidant protects rat pheochromocytoma (PC-12) cells against 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-induced neurotoxicity[J]. Int J Mol Med 2013; 32: 235-40.

4 Wang SW et al. Rutin inhibits beta-amyloid aggregation and cytotoxicity, attenuates oxidative stress, and decreases the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines[J]. Neurotoxicology 2012; 33: 482-90.

5 Wang W et al. Rutin protects endothelial dysfunction by disturbing Nox4 and ROS-sensitive NLRP3 inflammasome [J]. Biomed Pharmacother. 2017; 86:32-40.

6 Khan MM et al. Rutin protects the neural damage induced by transient focal ischemia in rats[J]. Brain Res 2009; 1292: 123-35.

7 Magalingam KB et al. Rutin, a bioflavonoid antioxidant protects rat pheochromocytoma (PC-12) cells against 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-induced neurotoxicity. Int J Mol Med 2013; 32: 235-40.

8 Sun HY et al. Age-related changes in mitochondrial antioxidant enzyme Trx2 and TXNIP-Trx2-ASK1 signal pathways in the auditory cortex of a mimetic aging rat model: changes to Trx2 in the auditory cortex. [J]. FEBS J 2015; 282(14):2758-74.

9      Dubey S et al. Rutin as a Natural Therapy for Alzheimer's Disease: Insights into its Mechanisms of Action[J]. Curr Med Chem 2016; 23(9):860-73.

10     Zhang S et al. Effects of troxerutin on cognitive deficits and glutamate cysteine ligase subunits in the hippocampus of streptozotocin-induced type 1 diabetes mellitus rats[J].Brain Res 2017; 1657:355-360.

11 Liaquat L et al. Development of AD like symptoms following co-administration of AlCl3 and D-gal in rats: A neurochemical, biochemical and behavioural study[J]. Pak J Pharm Sci 2017 ;30(2(Suppl.)):647-653.

12 Zhang C et al. Lipid-mediated cell signaling protects against injury and neurodegeneration[J]. J Nutr 2010; 140: 858-63.

13 Zhang X et al. Catalpol improves cholinergic function and reduces inflammatory cytokines in the senescent mice induced by D-galactose[J]. Food Chem Toxicol 2013; 58: 50-5.

14 Yang YC et al. Rutin, a Flavonoid That Is a Main Component of Saussurea involucrata, Attenuates the Senescence Effect in D-Galactose Aging Mouse Model[J]. Evid-Based Compl Alt 2012.

15 Wu W et al. Astrocyte activation but not neuronal impairment occurs in the hippocampus of mice after 2 weeks of d-galactose exposure[J]. Life Sci 2011; 89: 355-63.