泰山医学院学报稿件信息
金银霜
（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）
摘要：近年来，零添加表面活性剂的可食性乳液技术发展迅速。本文旨在构建一种新型乳液体系，揭示天然大豆分离蛋白（SPI）稳定高内相乳液（HIPEs）的物化特性。对SPI的SDS-PAGE电泳、差示扫描量热特性（DSC），平均粒径，ζ 电位进行表征与测定，探讨了蛋白浓度对稳定HIPEs显微结构、油滴粒径及流变性质的影响。结果表明：实验室制备SPI颗粒性质优良，为天然低变性率SPI。新鲜制备的HIPEs呈凝胶状，将其放置在室温下储藏6个月后仍保持稳定，显微结构图表明其内部存在紧密堆积的网络结构。蛋白浓度为1.0 wt%时，SPI稳定HIPEs的最高油相体积分数为0.87 (v/v)。油相体积分数为0.8 (v/v)时，SPI稳定HIPEs的最低蛋白浓度为0.6 wt%。流变性质表明HIPEs内部存在以弹性为主的凝胶网络结构，随着蛋白浓度的增大，油滴粒径逐渐减小且呈均匀分布，粘弹性能逐渐增大。本研究对于开发高脂健康食品提供了新思路。
关键词：大豆分离蛋白；高内相乳液；凝胶网络结构；粘弹性能
Soy protein isolates as stabilizer for high internal phase emulsions
JIN Yin-shuang
(College of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)
Abstract : In recent years, there has been significant progress in edible emulsion technology. This paper aims to reveal the physicochemical properties high internal phase emulsions (HIPEs) stabilized by natural soy protein isolate (SPI). SDS-PAGE electrophoresis, differential scanning calorimetry, average particle size, zeta potential of SPI were characterized. The formation, microstructure and properties of HIPEs were characterized by visual observations, optical microscopy and dynamic oscillary measurements. The results showed that lab-extracted SPI was low denatured protein. The fresh HIPEs have gel-like apperaance, and remained visually stable at room temperature after 6 months, its microstructure showed that the formation of tightly packed network structure inside. We fabricated HIPE stabilized by SPI (oil fraction ϕ=0.1-0.87 (v/v) at protein concentration c=1.0 wt%; ϕ=0.8 (v/v) at c=0.6-2.0 wt%). Increasing protein concentration led to much lower droplet size and homogenized size distribution, stronger stiffness in HIPEs and enhancenment of viscoplastic properties. This study provides a new direction for the development of high-fat healthy food.
Key words: soy protein isolate; HIPEs; gel-like network microstructure; viscoplastic properties
大豆分离蛋白（SPI）是世界上产量最高的植物蛋白质之一，含有九种人体必需氨基酸，此外还含有异黄酮、维生素E、皂苷等对人体有益的功能性生理活性物质，常被冠之为“豆中之王”的美誉[1]。SPI具有优良的功能特性，主要包括溶解性、乳化性、起泡性、凝胶性和聚集性等[2]，被广泛应用于食品加工中，改善食品的质构特性。SPI包括清蛋白和球蛋白，根据大豆品种不同，约占总蛋白含量的50 ~ 90%。根据沉降系数，又可分为15S、11S、7S和2S，其中11S（球蛋白）和7S（β-伴大豆球蛋白）占比较高[3]。
高内相乳液（HIPEs）定义为内相体积分数超过0.74的乳液体系[4]。由于内相体积分数和黏度极高，通常也称其为乳液凝胶，广泛应用于化妆品、食品、催化剂载体、医药、生物反应器及组织工程领域[4,5]。传统的HIPEs一般是由大量表面活性剂稳定的，近年来固态胶体颗粒稳定的HIPEs被多次报道，它更安全且用量少，具有极大应用前景，其内部油滴具有抗聚结稳定性，形成粘弹性可调控的凝胶网络结构[6]，对食品质量保持和质构调控均有一定作用。HIPEs体系固有的低水分含量可提高其抑菌稳定性[7]，降低自身变质速率，减少防腐剂用量，从而延长食品的货架期。迄今为止，一系列有机或无机颗粒已被报道可作为高效乳化剂稳定HIPEs，比如微凝胶[8]、蛋白基颗粒[9,10]、多糖基颗粒[4,11,12]、改性二氧化硅颗粒[13]、羟磷灰石[14]、二氧化钛颗粒[15]、各种合成高聚物[16,17,18]等，其中只有极少一部分是食品级颗粒或适用于食品生产的。
在过去几十年里，科研工作者对SPI开展了大量工作，但关于其稳定HIPEs的研究鲜有报道。我们日常生活中的高浓度食品体系主要有蛋黄酱、冰淇淋、人造奶油等，然而这些产品所使用的乳化剂多为蛋黄、酯类等，长期食用对人体有害无益。研究表明，SPI具有丰富的营养成分，良好的乳化性质[8]，在此基础上，我们探究其在高浓度食品体系中是否仍具有优越性。本文以天然SPI为原料，用SDS-PAGE电泳、DSC热分析、颗粒粒径、ζ电位表征颗粒性质，通过乳液的外观、光学显微镜和动态震荡扫描，探究SPI稳定HIPEs的性质以及蛋白浓度对HIPEs的影响。
1 材料与方法
低温脱脂豆粕；福临门一级大豆油，购于广州华润万家；盐酸、氢氧化钠等化学试剂均为分析纯。
示差扫描量热分析仪DSC（美国TA Instruments公司）；电泳槽（北京六一仪器厂）；电泳仪（美国 Bio-Rad 公司）；Malvern Zetasizer Nano ZS粒度仪（英国Malvern公司）；高速分散器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；哈克流变仪（德国 Hakke 公司）
1.3 实验方法
1.3.1 SPI的制备
参考Liu[8]的方法制备SPI，并稍作修改。首先，将低温脱脂豆粕与去离子水按1:15 (w/w)比例混匀，用2 M NaOH将其pH调至8.0，低温搅拌2 h（每隔30 min复调pH至8.0），将混合液于8000 g离心30 min，去除豆渣。然后用2 M HCl将收集的上清液pH调至4.5，于6500 g离心20 min后，留取沉淀，用去离子水复溶，同时将溶液pH调至7.0直至沉淀完全溶解。最后将溶液置于4 ℃冰箱，用去离子水透析48 h（每隔12 h换一次水），冻干备用。
1.3.2 SPI的还原型十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
参考Zhu[18]的方法进行SPI的SDS-PAGE，并稍作修改。将2.0 wt% SPI使用样品缓冲液稀释至0.1 wt%，涡旋10s后，在100 ℃下加热5 min后冷却，于10000 rpm下离心5 min后，立刻取上清液10 μL加入样品槽（浓缩胶为5.0 wt%，分离胶浓度为12.0 wt%），标准蛋白质（Mark：分子量为14.4-97.4 KDa）在100 ℃下加热5 min冷却后直接上样。向电泳槽中倒入电泳缓冲液直至液面没过胶片，通电开始电泳，蓝色条带在浓缩胶内的电流设定为50 mA，进入分离胶后调至80 mA，待其下移至距分离胶底部3-5 mm处关闭电泳仪。最后，使用染色液将取出的胶片染色1 h，用脱色液脱色24 h，期间更换两次脱色液。（电泳缓冲液的配制方法：3.0 g三异丙基乙磺酰、14.4 g甘氨酸和1.0 g十二烷基磺酸钠加去离子水定容至1000 mL。样品缓冲液的配制方法：9.5 wt%三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（pH = 6.8）、0.1 wt%溴酚蓝、25% (v/v)甘油、2.0 wt% 十二烷基磺酸钠、5.0 wt% β-巯基乙醇和0.9 mL去离子水。）
1.3.3 SPI的DSC热分析
参考Zhu [18]的方法，用TA Q200-DSC进行热分析，并稍作修改。准确称取2.0 mg SPI（记录具体质量）置于TA Q20液体铝坩埚，加入10 μL 0.05 M PBS（pH=7.0），盖上铝盖压盘将其密封，室温静置平衡6 h后进行测定。将装有SPI样品的铝坩埚放置在DSC炉腔外侧电极，将一只密封好的空铝坩埚作为对照。以5 ℃/min的升温速率从25 ℃加热至110 ℃，氮气流速为50 mL/min。至少做两次平行重复试验。测得的DSC数据通过TA Universal Analysis 2000软件进行相关分析。
采用动态光散射技术（DLS）测定制备SPI的粒径分布及平均粒径。为避免多重光散射，测试之前需用0.05 mol/L PBS将SPI溶液稀释至0.1 wt%。为降低大颗粒杂质影响最终结果的可能，将去离子水过膜（0.22 μm）处理后，测定SPI的平均粒径和ζ电位。经过三次测量后，使用origin软件进行分析。
准确称取一定量的SPI溶于去离子水中(含有0.02 wt%叠氮钠)，室温搅拌2 h至充分溶解，并过夜水化。
1）不同油相体积分数（ϕ）下SPI稳定的乳液
将上述 SPI 溶液稀释至所需浓度（1.0 wt%），一次性加入大豆油（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.75，0.87，0.88 (v/v)），用高速分散机将油水混合物于5000 rpm均质2 min，形成乳液，4 ℃保存备用。
2）不同蛋白浓度（c）下SPI稳定的乳液
将上述SPI溶液分别稀释至其c为0.4，0.6，1.0，1.5，2.0 wt%，固定ϕ为0.8 (v/v)，用高速分散机将油水混合物于5000 rpm均质2 min，形成乳液，4 ℃保存备用。
乳液的粘弹性用哈克流变仪（德国）表征。将样品置于平行板（直径为27.83 mm）之间，间隙设为1 mm，抹去过多的样品，在样品裸露的边缘涂上一层薄薄的硅油以防止水分蒸发。扫描频率范围设定为0.1~10 Hz，应变γ固定为0.5 %，确保所有的测量在线性粘弹性区域，并记录样品的储能模量（G'）和损耗模量（G''）。
图1 SPI的SDS-PAGE凝胶电泳。
Fig.1 SDS-PAGE profile of SPI.
以还原型十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定实验室制备SPI的主要成分及其纯度。SPI所含7S球蛋白中α’、α和β亚基的分子量分别为72 KDa、68 KDa和52 KDa，11S球蛋白中AS和BS亚基的分子量分别为35 KDa，20 KDa[3]。电泳图（Fig 1）显示出了7S球蛋白、11S球蛋白的特征条带以及部分蛋白或亚基的大分子聚集体，这与Shen和Wu的报道结果相符[20,21]。结果证实，实验室制备SPI纯度较高。
2.2 SPI的DSC热分析
图2 SPI的DSC热分析图。
Fig.2 Representative DSC thermograms graph of SPI.
为确定实验室制备SPI的变性程度，对其进行DSC热分析。由图可见，SPI分别在74.73和93.49 ℃处存在吸收峰，这与Zhu[18]和Ryan [22]报道的7S、11S球蛋白分别在77.11和95.24 ℃、75.99和91.4℃存在吸收峰基本一致。因此实验室制备SPI为低变性蛋白。
Fig.3 Typical particle size distribution profiles of SPI.
为进一步确定实验室制备SPI的颗粒性质，将其分散液稀释到0.1 wt%测定平均粒径和ζ电位。结果表明：SPI分散液中粒径呈单峰分布，分布范围较窄（约4 ~ 20 nm），具有良好均一性。SPI的平均粒径为57.27 nm，和文献中[23,24]报道的50 ~ 70 nm基本一致。ζ电位是带电粒子双电层产生的电势，用以反映纳米级颗粒表面带电性质[25]。SPI的ζ电位为-43.7 mV，略高于Malhotra[26]报道的-50 mV，这可能是由于制备方法及原料产地不同所致。以上数据再次证实实验室制备SPI为低变性蛋白。作为纳米级颗粒，SPI粒径分布均匀，表面带有大量负电荷，这在一定程度上抑制了颗粒间聚集行为。SPI良好的颗粒性质为其乳化功能的实现——稳定HIPEs提供了基础。
图4：a) SPI稳定乳液的外观（室温放置12h后拍摄，c=1.0 wt%，ϕ=0.1 - 0.88 (v/v)；b,c）SPI稳定的脂肪上浮乳液或凝胶样乳液的光学显微结构图，ϕ分别为0.3，0.5，0.7，0.85，0.87 (v/v)。图中比例尺长度代表100 μm。
Figure 4. a) Visual observations of emulsions stabilized by SPI at a constant solid concentration(photoed after 12h at room temperature, c=1.0 wt%, ϕ=0.1 - 0.88 (v/v); b, c) Typical optical micrographs of creaming or gel-like emulsions stabilized by SPIs, at selected ϕ values of 0.3, 0.5, 0.7, 0.85, 0.87 (v/v), respectively. Scale bars represent 100 μm in length.
图4 a）为SPI稳定系列乳液的外观图，c=1.0 wt%，ϕ=0.1-0.88 (v/v)。可以看出，ϕ≤0.7 (v/v)时，乳液迅速发生相分离形成两层：脂肪上浮层（上层）和水相层（下层）。脂肪上浮层厚度随着ϕ的增加而增加（直至ϕ= 0.75 (v/v)）。当0.75≤ϕ≤0.87 (v/v)时，SPI构建了稳定的HIPEs，呈倒置不流动的凝胶状，这种外观也体现在壳聚糖或纤维素纳米晶[4,11,12]、微凝胶[8]、疏水改性后的二氧化硅粒子[27]、蛋白基颗粒[10]及蛋白-多糖、蛋白-果胶复合物[28,29]稳定的HIPEs中。ϕ=0.88 (v/v)时，SPI将无法稳定HIPEs，发生相分离，表明此时SPI颗粒数量及连续相体积不足以稳定乳液所产生界面面积，这在Zhang[30]和Li[8]的研究中也有体现。
图4 b, c）为脂肪上浮型乳液和HIPEs的光学显微结构图，不难发现，乳液内部油滴尺寸分布广泛（从几微米到几十微米），这可能是因为实验采用的均质方式能量输入较低，难以形成内部结构高度均一，油滴粒径小的乳液[31]。随着ϕ增加（ϕ≤0.75 (v/v)），油滴上包裹的蛋白膜由厚变薄，这是由于在ϕ较低时，乳液中有大量的SPI颗粒可以用于稳定油滴，在界面上覆盖多层颗粒。同时，显微结构图显示油滴粒径以肉眼可见的速度增大，这和Liu[9]所观察到的现象一致，可能是由于SPI浓度不足以稳定新产生的界面面积。当0.75≤ϕ≤0.87 (v/v)时，乳液中油滴均处于紧密接触的状态，彼此间相互联系，类似于凝胶网络结构，这和文献中报道的一致[4,7,8]，当ϕ超过随机排列极限时，油滴将被固定在网络结构中不能再发生相对移动，这也是HIPEs呈类固体-凝胶状外观的原因[32]。
图5：a，b）新鲜制备和储藏6个月后SPI稳定HIPEs的外观(ϕ= 0.8 (v/v)，c分别为0.4，0.6，1.0，1.5，2.0 wt%)；c，d）新鲜制备乳液的光学显微结构图，c分别为0.6，1.0，1.5，2.0 wt%。比例尺代表的长度为100 μm。
Figure 5. a, b) Visual observations of freshly prepared (0 h) and stored (after 6 months) HIPEs stabilized by SPI (ϕ=0.8(v/v), at select c values of 0.4, 0.6, 1.0, 1.5 and 2.0 wt %, respectively); c, d) Typical optical micrographs of fresh HIPEs, at selected c values of 0.6, 1.0, 1.5, 2.0 wt%, respectively. Scale bars represent 100 μm in length.
图5为当ϕ=0.8 (v/v)，c=0.4，0.6，1.0，1.5，2.0 wt %时，SPI稳定HIPEs的外观和微观结构图。ϕ固定时，HIPEs的性质极大地取决于连续相中SPI的颗粒浓度。c≤0.4 wt%时，由于连续相颗粒不足，无法形成稳定的HIPEs。c=0.5 wt%时，形成的HIPEs流动性较强，这可能是由于SPI颗粒刚刚可以稳定油滴产生的高界面面积，处于临界浓度，内部网络结构强度弱，宏观上表现为流动型HIPEs。传统的HIPEs一般需要10-50 wt%的表面活性剂[33,34]稳定，而我们发现，当SPI c≥0.6 wt%时，即可形成凝胶样HIPEs，外观呈乳白色，滴入水中可分散均匀，是典型的水包油型（O/W）乳液。它具有较强的脂肪上浮稳定性，室温储藏6个月后仍保持稳定。
通过显微结构图（Fig.5 c, d），可以观察到大量油滴处于高度紧密堆积、相互联系的状态。随着c逐渐增大（0.6→2.0 wt%），HIPEs的油滴粒径逐渐减小，并趋向于均匀分布，这在Tan[35]的研究中也有体现，是由于增加颗粒浓度为乳化提供了更多稳定剂，可稳定的界面面积更大。这在实际应用很重要，因为油滴大小及包埋脂溶活性物质负载率可通过变化蛋白浓度进行调节[35]。ϕ如此高但油滴并未发生大范围凝聚，可能是因为油滴界面覆盖的颗粒与连续相中未吸附至界面的颗粒发生相互作用，把油滴嵌入三维网络中，形成空间壁垒阻止油滴凝聚[36,37]。另外，当蛋白浓度较低时，颗粒不足以稳定高速剪切所形成的高界面面积，油滴逐渐发生融合形成相对较大的体积，直至蛋白颗粒可以稳定为止。此时油滴体积较大，覆盖在其表面的蛋白颗粒较少难以发生絮凝，油滴易于发生融合，凝胶网络结构较弱。蛋白浓度较高时，颗粒足以稳定高速剪切所形成的油滴界面，在油滴表面形成致密的多层蛋白颗粒，颗粒表面所带负电荷使其在引力和斥力间保持平衡，减慢了油滴凝聚的速率。
2.6 不同蛋白浓度下SPI稳定HIPEs的粘弹性能
图6：HIPEs的储能模量G'和损耗模量G''的频率依赖图。所有频率扫描实验都在粘弹性范围内（应变γ为0.5%）。
Figure 6. Representative frequency dependence profiles of storage (G' : filled) or loss (G'' : open) moduli for the corresponding HIPEs. All the frequency sweep experiments were performed in the viscoelastic range ( strain γ=0.5%).
流变学测试为认识乳液的复杂结构提供了途径，它常常在食品开发领域作为一种指标进行评估[30]。为了确定SPI浓度对HIPEs网络结构强度的影响，通过动态震荡扫描表征其流变学特性。
如图6所示，在测试频率范围内（0.1-10 Hz），所有HIPEs的储能模量（G'）远远大于损耗模量（G''），说明它是以弹性为主导的凝胶网络结构。一方面，与传统的表面活性剂稳定的HIPEs呈现的塑性流动不同，Dimitrova的研究揭示，刚性蛋白稳定的HIPEs往往具有高粘弹性的特征[38]。另一方面，在所有的蛋白浓度下形成的HIPEs内部油滴均排列紧凑（Fig 5c, d），这是HIPEs的普遍特性[6,10,11]，Aken认为不同油滴上吸附的蛋白膜之间可能发生物理交联（比如疏水相互作用、氢键）和化学交联（比如二硫键）作用[39]。这两方面因素促使HIPEs形成以弹性为主的凝胶网络结构。G'和G''随着震荡频率的增加呈略微上升的趋势，这在Liu[40]所研究的低温冷致大豆蛋白凝胶样乳液中也有体现，这表明凝胶网络结构与热诱导蛋白凝胶类似，是由非共价物理交联所致[41]。
在特定测试频率范围内，HIPEs的G'和G''随c增加（0.6→2.0 wt%）而增大（Fig 6），表明凝胶网络结构强度增大。这可能是两方面因素所致，一方面，SPI分散液中可能存在部分颗粒聚集体，c增加使颗粒聚集体随之增多。研究表明，水相中颗粒的弱聚集作用可以提高乳液稳定性，对此可能的解释是：由于聚集体比单个颗粒的相对惯性大，使其在高速分散时更容易吸附至油水界面[42,43]，界面膜厚度增大，粘弹性质增强。另一方面，HIPEs的显微结构图表明（Fig 5），随着蛋白浓度的增加，油滴粒径逐渐减小且呈均一化。小油滴数目增加，使网络结构更加致密，易于界面蛋白颗粒间发生物理交联，增强网络结构强度。这与明胶颗粒[6]、麦醇溶蛋白[10]等稳定的O/W HIPEs中观察到的现象一致。
3 结论
本实验以低温脱脂豆粕为原料，使用 “碱溶酸沉法”制备了SPI。采用一步乳化法制备HIPEs，探究了SPI稳定HIPEs的能力。研究证实SPI可作为高效乳化剂稳定O/W HIPEs，外观呈凝胶状，倒置不流动，内部油滴呈紧密堆积状态，在室温下储藏6个月后仍保持稳定。SPI稳定HIPEs的最高油相体积分数为0.87 (v/v)（c=1.0 wt%），形成HIPEs的最低蛋白浓度为0.6 wt%（ϕ=0.8 (v/v)）。流变特性表明HIPEs是以弹性为主的凝胶网络结构。提高SPI浓度可降低HIPEs的油滴粒径，并促进粒径均匀分布，增大凝胶网络结构强度，增强粘弹性质。SPI作为HIPEs的稳定剂实现了脱脂豆粕的二次利用。制备方法方便快捷，形成HIPEs储藏稳定性好，在实际工厂化生产中具备较强的可操作性。本工作对高脂健康食品的开发具有一定指导意义。
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