贯筋藤提取物对小鼠迟发型超敏反应的影响

刘威良，姬昱，海冰，皮渤淼，苏慧敏，吴白芬，黄艾祥

（云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201）

摘要: 目的：贯筋藤作为云南民间一种特色的药食同源植物，探究其提取物对小鼠迟发型超敏反应（DTH）的影响。方法：以贯筋藤及其料渣为原料，乙醇超声萃取的方法制备贯筋藤粗提物，采用泼尼松连续灌胃建立免疫抑制小鼠模型，以2,4二硝基氟苯诱导DTH，检测贯筋藤提取物对模型小鼠耳肿胀度的影响，计算胸腺和脾脏指数，酶联免疫吸附法检测小鼠血清干扰素-γ（IFN-γ）含量。结果：明显减轻正常免疫小鼠耳廓肿胀度，对免疫抑制小鼠有减轻趋势；对小鼠胸腺和脾脏指数的影响无显著性差异；显著性降低正常免疫小鼠血清IFN-γ含量，对免疫抑制小鼠有降低趋势。结论：贯筋藤提取物对DTH小鼠具有明显的免疫抑制作用，其作用机制可能是通过抑制淋巴细胞分泌IFN-γ水平。

关键词：贯筋藤；贯筋藤料渣；迟发型超敏反应；IFN-γ；免疫抑制

Effect of Dregea sinensis Extract on Delayed Type Hypersensitivity model of murine

LIU Wei-liang¹,JI Yu²,HAI Bing²,PI Bo-miao²,SU Hui-min²,WU Bai-fen²，HUANG Ai-xiang^2*

(College of Food Science and Technology; Yunnan Agricultural University，Kunming 650201）

Abstract: Object: Dregea sinensis Hemsl is a kind of medicinal and edible homologous plant in Yunnan folk, to investigate the effect of the ethanol extrat of Dregea sinensis Hemsl on delayed type hypersensitivity(DTH). Methods: In this experiment,making use of the material of Dregea sinensis Hemsl and its dregs,utilizng alcohol and ultrasonic to prepare the crude extraction, the immunosuppression mice models were established with intragastric administration of prednisone acetate successively, the DTH model of mice induced by dinitrofluorobenzene,to detect the influence of the ethanol extract of the Dregea sinensis Hemsl on the swelling of ears of DTH mice ,which the thymus and spleen indexes were calculated,the levels of IFN-γ in mouse serum was detected by ELISA. Results: The swelling of ears of the normal immune mice has significantly decreased,the immunosuppression mice have the trend of alleviation;it has no significant difference in the thymus and spleen indexes;it has remarkably decreased the levels of IFN-γ in the serum of the normal immune mice, the immunosuppression mice have the trend of reduction. Conclusions:The ethanol extract of the Dregea sinensis Hemsl showed significantly immunosuppressive effect on DTH in mice by a possible mechanism of suppressing the level of INF-γ production in lymphocytes.

Key words: Dregea sinensis Hemsl; Residual; Delayed Type Hypersensitivity; IFN-γ; Immunosuppression

贯筋藤（Dregeasinensis Hemsl.var.corrugataTsiang etp.t.）为萝藦科（Asclepiadaceae）南山藤（Dregea E.Mey）属植物苦绳（Dregea sinensis Hemsl）的一个变种，俗称“奶浆藤”，主产云南大理、丽江、昆明等地，广西、贵州也有分布，生长在海拔500～3000米的山地森林或灌木丛中^{[1, 2]}。贯筋藤的干茎是我国傣族医药（傣百解胶囊）的一味药材，用于治疗痈疮疖肿，风湿弊痛，咳嗽痰喘等病症^[3]。现代药理学研究表明贯筋藤具有抗癫痫、抗肿瘤、抗炎、抗寄生虫及免疫调节等多种生物活性^{[4, 5]}。

目前关于贯筋藤的研究主要集中在贯筋藤蛋白酶和小分子功能物质方面，如黄艾祥课题组对贯筋藤蛋白酶进行了相关研究^{[6, 7]}，中科院昆明植物研究所对贯筋藤中的小分子活性物质进行了分离鉴定^[8]。贯筋藤提取蛋白酶后丢弃造成大量的资源浪费，本文以贯筋藤干茎和经水提后的料渣作为实验对象，探究其醇提物对小鼠迟发型超敏反应的影响，初步探讨了其可能的作用机制，为贯筋藤保健食品及药品开发提科学依据，为贯筋藤料渣资源高效利用提供新的途径。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

贯筋藤鲜茎采自云南大理州剑川县，海拔2000～3000m山地森林或灌木丛中。

1.2 实验试剂

醋酸泼尼松（批号：20170518），浙江仙琚制药股份有限公司；2,4二硝基氟苯（DNFB）（批号：20170916）；无水乙醇（分析纯，批号：20171025），天津市风船化工股份有限公司；丙酮（批号：20170801），天津市风船化工股份有限公司；橄榄油（批号：20180520），上海化学试剂公司；血清干扰素-γ（IFN-γ）小鼠 ELISA试剂盒（批号:20180410），武汉华联生物科技有限公司；羧甲基纤维素钠（批号：F20170909），国药集团化学试剂有限公司。

1.3 实验仪器与设备 

400Y多功能粉碎机（永康市铂殴五金制品有限公司）；Scientz-500C多功能恒温超声萃取仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；RE520旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； TDL-5-A离心机（上海安亭科学仪器厂）；Thermo1500全波长酶标仪（芬兰雷勃公司）； HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；直径8mm打孔器（湖北医疗器械一厂)。

1.4 实验动物

SPF级昆明种小鼠，雄性，体重（18~22g），由昆明医科大学实验动物中心提供[SYXK（滇）K2013-0004]。

2实验方法

2.1样品的制备^{[6, 9]}

贯筋藤及料渣醇提物：称取1kg贯筋藤干茎，粉碎，加入70%乙醇，料液比为1:10，超声提取（功率600W，25℃，工作间歇比2s/2s）30min，用纱布过滤，旋转蒸发仪浓缩至无醇味，真空冷冻干燥备用；称取1kg贯筋藤干茎，洗涤敲断20倍水浸泡（60℃，30min）提酶后得料渣，放烘箱50℃烘干后同法制备料渣醇提物，临用时用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成悬浮液。

2.2 小鼠DTH模型的建立^[10]

实验第一天（诱导期），将小鼠腹部固定部位用剃须刀剪短，然后用脱毛膏去毛，面积为3cm×3cm，局部均匀涂抹1% DNFB的丙酮-橄榄油溶液（1:1）100mL，第二天同样方法致敏一次，第六天（激发期）将1%DNFB的丙酮-橄榄油溶液（1:1）20mL，均匀涂于小鼠右耳廓进行激发，左耳涂等量的丙酮-橄榄油溶液（1:1）作对照。

2.3 动物分组及处理

将84只小鼠按体重随机分成7组，每组12只，即空白组、模型组、泼尼松组、贯筋藤醇提物组、贯筋藤料渣醇提物组、贯筋藤醇提物+泼尼松组、贯筋藤料渣醇提物+泼尼松组。各组均灌胃给药，给药组给予相应药物（生药量）10g/kg，醋酸泼尼松10mg/kg，空白和模型组给予同等剂量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。自致敏前1d开始，连续给药6d，至末次给药后30min，开始激发，24h后摘眼球取血后脱颈椎处死小鼠，剪下两耳，同时取胸腺和脾脏。

2.3.1耳廓肿胀度的检测

将左右耳廓用直径8mm打孔器同部位等面积切下耳片，称重，计算肿胀度：耳廓肿胀度（mg）=右耳重（mg）－左耳重（mg），耳廓肿胀抑制率（%）=(模型组耳肿胀度－给药组耳肿胀度)／模型组耳肿胀度×100%^[11]。

2.3.2脏器指数的测定

将剖下的脾脏和胸腺用生理盐水冲洗，滤纸吸干表面水分，称重并计算: 脾脏指数（mg／g）=脾脏重量／体重；胸腺指数（mg／g）=胸腺重量／体重^[12]。

2.4统计学处理方法

所有数据均用SPSS18统计软件进行统计，所得数据以`x±S表示，组间比较采用t检验，p＜0.05表示组间差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 贯筋藤提取物对迟发型超敏反应模型小鼠耳肿胀度的影响

本研究表明，模型组与空白组比较，小鼠耳廓肿胀度明显升高（p＜0.01）；与模型组比较，泼尼松组和正常免疫组小鼠耳廓肿胀度明显抑制（p＜0.01）；与泼尼松组比较，免疫抑制组小鼠耳廓肿胀度有减轻的作用趋势，但无统计学差异（p＞0.05），结果见表1。

表1贯筋藤提取物对迟发型超敏反应模型小鼠耳肿胀度的影响（`x±S）

与空白组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与模型组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

3.2 贯筋藤提取物对迟发型超敏反应模型小鼠免疫器官重量的影响

本研究显示，与空白组比较，模型组小鼠胸腺和脾脏指数无显著性变化（p＞0.05）；与模型组比较，泼尼松组小鼠胸腺和脾脏指数明显降低（p＜0.01），正常免疫小鼠无显著性变化（p＞0.05）；与泼尼松组比较，免疫抑制小鼠胸腺和脾脏指数有降低趋势，但无统计学差异（p＞0.05）结果见表2。

表2贯筋藤提取物对迟发型超敏反应模型小鼠免疫器官重量的影响（`x±S）

与空白组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与模型组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

3.3 贯筋藤提取物对迟发型超敏反应模型小鼠血清IFN-g的影响

本研究表明，与空白组比较，模型组小鼠血清IFN-γ含量明显升高（p＜0.01）；与模型组相比，正常免疫小鼠血清IFN-γ明显降低（p＜0.05）；与泼尼松组比较，免疫抑制小鼠呈现降低趋势，但没有统计学意义（p＞0.05），结果见表3。

表3贯筋藤提取物对迟发型超敏反应模型小鼠血清IFN-g的影响（`x±S）

与空白组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与模型组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

4 讨论

DTH是由特异性致敏T细胞介导的细胞免疫反应，T细胞在自身免疫、肿瘤免疫、移植物排斥反应等方面起着重要作^[13]。DNFB是一种半抗原，将其稀释液涂抹于腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T细胞增殖活化为致敏T细胞，经过抗原提呈细胞作用效应T细胞后，释放一些细胞因子如IFN-γ、IL-2等，产生炎性细胞浸润为主的细胞免疫损伤效应^[14]。研究表明，DNFB诱导的DTH模型是一种免疫性模型，对T细胞在炎症免疫性疾病的研究中有一定指导意义。

本实验以DNFB诱导，成功复制小鼠DTH模型，初步探讨贯筋藤提取物对DTH的影响及作用机制，实验结果显示，贯筋藤提取物使正常免疫小鼠的耳廓肿胀度明显减轻（p＜0.01），醋酸泼尼松抑制了小鼠的细胞免疫功能，致使DNFB很难诱发出小鼠耳廓的肿胀，经贯筋藤提取物干预后，各组小鼠耳廓肿胀度有减轻趋势，表明它具有协同免疫抑制剂的作用。

在机体中，胸腺是重要的中枢免疫器官，是T细胞分化、发育的场所，主要参与细胞免疫；脾脏是产生致敏淋巴细胞和抗体的场所，其中大量的T淋巴细胞、B细胞在机体防御和清除功能中发挥重要作用^{[15, 16]}。因此胸腺和脾脏指数是两个衡量模型动物体内免疫水平的关键指标。研究表明醋酸泼尼可通过使脾脏和胸腺出现不同程度的萎缩达到细胞免疫抑制作用^[17]，本研究中贯筋藤提取物对各组小鼠的胸腺和脾脏指数作用不明显，则其发挥细胞免疫抑制作用的机制与泼尼松不同。另外，T细胞中的Th1亚群细胞主要介导细胞免疫是DTH的效应细胞，在增强炎症反应中起重要作用，IFN-γ是Th1细胞分泌的细胞因子可调节T细胞增殖和免疫性、提升有效的DTH反应等方面^[18]。本实验结果显示，贯筋藤提取物可明显降低正常免疫小鼠血清IFN-γ的水平，可能是其抑制DTH反应的作用机制。考虑给药剂量对免疫的调节作用具有双向性，实验有待进一步研究。

综上所述，贯筋藤作为一种药食同源植物，其醇提物对小鼠细胞免疫主要形式之一的DTH反应有一定的抑制作用，其机制可能与抑制DTH中Th1细胞IFN-γ的分泌水平有关，推测其在体内免疫抑制剂的应用上有更值得深入研究的价值。这为以后保健食品及药品的研发提供数据支撑，也为贯筋藤料渣资源高效利用提供新的途径。

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