基于代谢组学探讨逍遥散抗抑郁症的作用机制

作者：肖洁

文章已被中国药物依赖性杂志社录用,中国药物依赖性杂志投稿链接：http://www.zazhi114.cn/zhongguoyaowuyilaixing

摘要：逍遥散对于抑郁症的治疗具有明确的作用。但是关于逍遥散治疗抑郁症方面的疗程、永用药量以及处方，仍旧存在很大的不确定性；在疗效评价及作用机制方面，也存在缺乏规范的、定性的标准。基于这一情况，本文使用代谢组学的方法，对逍遥散治疗抑郁症的成效及作用机理进行研究。研究发现，逍遥散在抗抑郁症方面具有显著疗效，通过代谢组学的研究方法发现，抑郁症患者的代谢机制受到了干扰抑制，抑郁症患者血浆内的一些内源性代谢物产物发生了异常变化，而在逍遥散干预下逐渐回调；尿液代谢组学分析表明，逍遥散的治疗效果可能部分是基于对能量代谢、肠道微牛物、色氛酪代谢及牛磺酸代谢的有效调节。

关键词：抑郁症；逍遥散；作用机制；疗效

引言

抑郁症以情绪低落为主要临床，表现具有发病几率高、病情反复、致残致死几率高等问题，已经被世界卫生组织列为世界重大危害疾病，并且预测2020年，抑郁症将会成为第二大视界重大危害疾病。随着抑郁症现象的多发以及各类抑郁症自残、自杀案件的宣传，其已经成为受到广泛关注的精神问题。同时因为抑郁症的发病机制复杂、且病情混杂其他症状，给患者自身及医生的临床判断带来了非常大的困难。因此当前抑郁症的准诊断，主要是以情感、思维客观指标作为依据，而缺乏定性的诊断标准，这也使抑郁症的及时确诊与治疗难度大，被误诊现象多见。

抑郁症诊断后，传统的抑郁症治疗一般采用西医治疗方法，这种方法具有用药简单、药效发挥快、效果明确的特征；同时也有用药后副作用大、抗抑郁谱窄及病情易反复发作等问题[[i]]。因此研究者开始关注我国传统中药在治疗抑郁症方面的作用，并将逍遥散引入到抑郁症治疗中。相对于传统的西医疗法，以逍遥散为代表的中药治疗，具有副作用小、多成分、多靶点的治疗作用，且能够对患者起到整体层面的调节，具有更好的疗效。

逍遥散作为舒肝解郁的经典名方，经过长时间的临床研究和大量的药理研究，均表明逍遥散对于抑郁症的治疗具有明确的作用。但是关于逍遥散治疗抑郁症方面的疗程、永用药量以及处方，仍旧存在很大的不确定性；在疗效评价及作用机制方面，也存在缺乏规范的、定性的标准，影响到以逍遥散治疗抑郁症的临床应用。

基于这一情况，本文使用代谢组学的方法，对逍遥散治疗抑郁症的成效及作用机理进行研究。代谢组学采取自上而下的研究方法，对代谢的多元产物进行多元化综合分析，从而展示生物整体的内在变化，以帮助人们更好地认识病理变化过程及体内物质的代谢途径和代谢状况。将代谢组学引入中医医学理论，分析逍遥散在治疗抑郁症方面的效果，可以使逍遥散的治疗效果更为直观明确，同时还能够根据代谢组学的具体数据分析其在治疗抑郁症方面的作用机制。

二、逍遥散配置与实验样本选择

逍遥散是具有确切抗抑郁作用的经典名方，出自《太平惠民和剂局方》，由柴胡、当归、白芍、白术、获荃、甘草、生姜、薄荷组成。该方主要功效为疏肝解郁、健脾和营，主治肝郁血虚，脾失健运之症[[ii]]。

研究开始前，运用代谢组学技术对逍遥散抗抑郁作用最佳剂量进行药效筛选，筛选出SD大鼠逍遥散的最佳给药剂量是46.3g/kg，换算成临床上人的日用剂量(原处方生药材比例)，约为370g。确定逍遥散配方饮片组成:柴胡、当归、白芍、(炒)白术、获菩各60g，生姜、薄荷各20g,(炙)甘草30g。所有中药饮片均进鉴定为正品。

病例来源为XX医科大学第一附属医院中医科或精神卫生科就诊的抑郁症患者。入组标准:根据《中国精神疾病分类及诊断标准》(CCMD-3)诊断标准诊断为单次或反复抑郁发作的患者；17分≤基线时的HADE 17项评分＜24分；同时参考中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》及参考有关抑郁症的文献，由本课题组中医专家制定逍遥散类方《中医证候量表》，该量表14项评分≥24分；年龄18-65岁，男女不限，门诊或者住院患者；抑郁症状至少1个月；经XX医科大学第一附属医院伦理委员会同意，所有患者均签署书面知情同意书。排除标准:双相障碍抑郁发作者;伴精神病性症状者;HAMD自杀条目评分≥3分者；妊娠期、哺乳期或计划在试验期间妊娠期间妊娠的妇女；有癫痛病史者；一年内使用过抗抑郁药物者;筛选前一个月内参加过其他药物临床试验者；具有严重的不稳定的躯体疾病者；一年内有符合诊断标准的酒精和药物滥用或依赖者。

参与本课题所有受试者服用的逍遥散水煎剂是由医院煎药室统一煎煮，每次发放两周量的药，本研究所有受试者接受了8周治疗，即在0、2、4、6周共领取四批药材，为此考察了不同批次药材间水煎剂质量差异。

因为本研究要求入组患者要接受8周逍遥散治疗，且入组患者要求每两周取一批药品，共去医院领取四批，也是存在不可控因素的。为保证临床试验可靠准确，必须保证药品来源、质量的可靠。因此，每批药材的质量、煎煮方法和时间、贮存等都做了严格把关。根据药典方法，经过HPLC对逍遥散水煎剂芍药营含量的测定，证明了不同批次及不同保存时间逍遥散水煎剂芍药昔含量是没有显著性差异的，即煎煮方法的重现性较好，患者每次领取试验所用药物质量稳定性较好及药物在40℃冰箱保存两周是比较稳定的[[iii]]。

三、基于血浆代谢组学的逍遥散抗抑郁症疗效与机制研究

血液作为人体代谢的媒介，能提供实时纯净的生物信息，因此，血液代谢组学研究是可靠的、必不可少的。作为一种高度平衡的生物体系，血液中的物质种类、含量相对稳定，若种类发生增减或某种成分的含量发生异常，可能意味着某个特定的生理病理出现异常，或组织、器官发生代谢障碍。所以，血液中代谢物的含量检测在临床诊断、生理病理等研究中具有非常重要的作用。

治疗组:治疗期间依从性较好的14例受试者的血浆样本。

健康对照组:根据与治疗组受试者年龄、性别等相当条件选取了14例健康志愿者的血浆样本，其中女性10人，男性4人，年龄49.6±6.8，HAMD评分20.7±2.1。

治疗组受试者要求在治疗前及8周治疗后分别使用含有肝素钠的真空采血管采集5ml静脉血，使用NMR代谢组学方法完成数据采集。

研究发现，抑郁症患者的血浆代谢轮廓在抑郁症的干扰下发生了显著的变化，与健康对照组相比，抑郁症患者具有较低水平的氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、撷氨酸、丙氨酸、谷氨酸)，其他代谢产物(β-羖轻基丁酸、丙酮酸、柠檬酸、肌醉、氧化三甲胺)和较高水平的乳酸、N-乙酞糖蛋白[[iv]]。这些代谢产物参与多种生化过程，表明由于抑郁症影响引起了相应的生化变化[[v]]。

为确定逍遥散是否对抑郁症患者代谢轮廓产生了影响，对抑郁症患者治疗前后NMR图谱进行PLS-DA分析，发现表抑郁症患者的血浆代谢轮廓经过逍遥散治疗发生了显著的变化。最终确定11种代谢标志物浓度发生了显著回调，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸5种氨基酸和其他代谢产物(β-羖轻基丁酸、丙酮酸、柠檬酸、肌醉、TMAO)显著增加及乳酸水平显著下降。

相比治疗前，经过逍遥散治疗后患者更接近于健康对照组。抑郁症患者治疗前后与健康对照组对比分析所得的代谢标志物的变化结果见表1。抑郁症患者大部分代谢标志物浓度从抑郁状态回归到正常，直接反映逍遥散对抑郁症患者代谢变化的影响[[vi]]。

表1 8周治疗后潜在抑生物标志物的变化

研究结果发现，12个内源性代谢标志物物受抑郁症影响发生了显著变化，包括氨基酸、有机酸和脂类等，而这些代谢标志物变化同样引起了相关联的代谢途径变化，而逍遥散对抑郁状态引起的代谢变化起到了很好地调节作用[[vii]]。

异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸因为有脂肪族侧链，称为支链氨基酸(BCAAs)。与健康对照组相比，支链氨基酸浓度在抑郁症患者体内显著降低。BCAAs浓度的降低会干扰脑内5-HT的释放致使出现中枢疲劳，疲劳是抑郁症的常见症状[[viii]]。支链氨基酸作为氨基酸供体可以快速跨越血脑屏障在脑内合成谷氨酸。谷氨酸，它是一种重要的神经递质，在抑郁症患者体内显著降低。谷氨酸合成减少可能导致抑郁行为的发生[[ix]]。因此，支链氨基酸和谷氨酸代谢异常是在一定程度上导致了抑郁的发生。

乳酸是葡萄糖在厌氧条件下代谢的最终产物。抑郁症患者的血浆中乳酸水平

增加表明葡萄糖代谢(糖酵解和葡萄糖氧化途径)受到抑制[[x]]。这种抑制作用可能是与厌氧细胞呼吸相关的，这是一个能量代谢过程，此时表明代谢能力出现下降[[xi]]。

丙氨酸、丙酮酸和柠檬酸水平在抑郁症患者体内是显著下降的。据推测，谷氨酸通过谷氨酸脱氢酶转化成α-酮戊二酸，丙氨酸通过转氨基作用转化为丙酮酸。丙酮酸是糖酵解的最终产物，它可以通过丙酮酸脱氢酶复合物进一步转化成乙酞辅酶A，进一步进入TCA循环[[xii]]。此外，α-酮戊二酸和柠檬酸都是TCA循环重要的中间体。因此，丙氨酸、丙酮酸和柠檬酸的降低会使TCA循环的减弱。TCA循环的减弱会导致的线粒体中ATP产生减少，可能导致疲劳[[xiii]]。另外，抑郁症患者体内肌配降低也导致了能量不足。

因此，丙酮酸、丙氨酸、柠檬酸、肌醉水平下降及和乳酸水平增加，表明抑郁状态所造成的能量代谢紊乱[[xiv]]。精力不足或疲劳是抑郁症患者最常见症状。

酮体是脂肪酸代谢的中间体，对中枢神经系统提供保护作用。β-羖轻基丁酸是一种很重要的酮体，它在抑郁症患者血浆中浓度的下降表明肝郁状态下能量代谢紊乱[[xv]]。

研究结果表明，抑郁症患者的代谢机制受到了干扰抑制。研究通过代谢组学技术分析发现抑郁症患者血浆内的一些内源性代谢物产物发生了异常变化，而在逍遥散干预下逐渐回调。总之，逍遥散通过调整氨基酸代谢，能量代谢，酮体和其他代谢途径发挥了很好地抗抑郁作用。

四、基于尿液代谢组学的逍遥散抗抑郁症疗效与机制研究

血浆代谢组学研究为抑郁症的临床诊断和逍遥散抗抑郁作用的研究提供了很好的思路和方法。而和血浆相比，尿液作为作为人体代谢的媒介，具有获取方便、获得对机体无损害的优点，且蛋白含量低，包含更多小分子代谢物信息，得到了越来越广泛的应用[[xvi]]。尿液可以方便在不同时间点连续多次取样，不会造成二次刺激，利于动态考察代谢物的变化。尿液的组成及其代谢物的浓度受机体各系统功能状态的直接影响，可反映机体的代谢状况，对全身器官、系统疾病的诊断有重要意义。

本研究选择了受试者中治疗期间依从性较好的21例受试者的尿液样本其中男性6人，女性15人，年龄48±8.9，HAMD评分19.67±2.05。受试者要求在治疗前及分别在服药2、4、6、8周末，各用10ml EP管收集早晨第一次尿液。使用NMR方式完成数据采集工作。

基于实验室的代谢组学平台，对抑郁症患者0周及治疗后2周、4周、6周8周末的尿液NMR图谱分别进行PCA, PLS-DA和OPLS-DA分析。

对抑郁症患者治疗前后尿液NMR数据经进行PLS-DA分析发现，治疗后2周与治疗前分离度较小，说明此时几乎没有发生明显的代谢变化。治疗后4周后与治疗前有明显分离趋势，且随治疗时间延长分离趋势越明显。治疗8周后距离治疗前最远，说明治疗2周后体内代谢变化还不是很明显，从第4周开始，抑郁症患者尿液样本中的代谢物发生了明显变化，第8周时代谢变化达到最大。

基于各组平均峰面积差异进行PCA分析，最终8种代谢物被确定为逍遥散治疗抑郁症的潜在生物标志物[[xvii]]（表2所示），进过分析发现，黄尿酸，牛磺酸，α-酮戊二酸8周治疗后显著增力；此外，乳酸、丙氨酸、柠檬酸和二甲胺是8周治疗后显著减少。乳酸、肌酐、黄尿酸、朽檬酸、丙氨酸和二甲胺经过4周、6周的治疗后与8周治疗后有相同的变化趋势(P＜O.O5)。2周治疗后只有肌酐水平显著增加(P＜O.O5)，二甲胺、乳酸水平显著降低(P＜O.O5)。

表2 治疗后相对于治理前的尿液NMR图谱代谢标注物变化

机体在正常状态下时，体内各系统间是保持动态平衡的。当受到疾病侵扰，单靠自身受调节已经无法维持生理自身平衡时，疾病紊乱就会使改变一些内源性代谢物的种类、浓度，机体就会呈现疾病状态。药物治疗就是通过药物的干预作用使机体由失衡状态恢复到平衡状态。进行药物治疗时，患者身体内一系列生化指标都会发生变化，仅仅依靠传统测试的几个、片面的临床指标，不能反应药物对机体整体调节作用发生的变化。

代谢组学将人体作为一个完整的系统来研究，动态连续的监测、分析代谢物的改变而产生的信息。并在此基础上，定位相应的代谢标志物及机体代谢途径[[xviii]]。

这项研究中，我们研究了逍遥散治疗抑郁症引起的代谢变化。结果发现了8个内源性代谢标志物物受逍遥散影响在治疗过程中发生了显著变化，包括肌配、黄尿酸、牛磺酸、α-酮戊二酸、乳酸、丙氨酸、柠檬酸、二甲胺等，而这些代谢标志物变化同样引起了相关联的生化途径变化。

柠檬酸和α-酮戊二酸是三梭酸循环(TCA)的重要中间代谢产物，并且同糖代谢和能量代谢密切相关[[xix]]。α-酮戊二酸是连接细胞内碳一氮代谢的关键节点，其功能之一是与氨结合形成谷氨酸，然后形成谷氨酞胺；另一个功能是与细胞释放的氮结合，防止氮负荷。因此抑郁症患者尿液中柠檬酸和α-酮戊二酸的紊乱，标志着TCA能量代谢的紊乱[[xx]]。能量代谢低下直接导致活动抑制，是抑郁症最普遍的症状之一[[xxi]]。逍遥散治疗后，柠檬酸和α-酮戊二酸分别从第四周和第八周发生显著性变化。

乳酸的增加说明机体内糖酵解增加，而产能降低。另外乳酸一般与无氧呼吸有关，组织无法获得足够的氧或者氧气不足以维持能量消耗情况下，乳酸的浓度会上升，人就会被迫通过不同方式不断产生ATP，直到能量代谢发生紊乱[[xxii]]。乳酸因此可以用来评估供求失衡严重程度的指标[[xxiii]]。逍遥散治疗后，乳酸从第二周就出现明显下降，说明在逍遥散千预下，能量代谢紊乱得到一定程度调节。

肌醉是肌肉中的磷酸肌酸分解产物。而肌酸一磷酸肌酸系统在细胞能量转移中起到关键的作用，肌酸配量降低是引起疲劳的重要因素[[xxiv]]。逍遥散治疗2周后，通过对肌配水平的明显增加，使能量代谢得到一定程度恢复。

通过柠檬酸、a一酮戊二酸、肌配等代谢标志物的变化，可以说逍遥散治疗效果很大一部分可能是依赖于对能量代谢的调节[[xxv]]。二甲胺是大量存在于人体尿液中的有机胺。二甲胺是通过在肠道内的细菌的酶对胆碱和肉毒碱的降解生成，然后由肝脏内黄素单加氧酶系统氧化成氧化三甲胺[[xxvi]]。有研究，抑郁症患者尿液中二甲胺的改变可能是抑郁症和肠道菌群紊乱之间的关系的证据[[xxvii]]。正常情况下，肠道菌群落之间是保持动态平衡的，可以参与宿主的生化代谢、病理生理等多种生命过程，是人类代谢网络重要组成部分。人体很多疾病的发生与肠道菌群紊乱有关，通过中药整体调节作用使机体恢复平衡与肠道菌群动态平衡观念一致，因此，中药治疗以肠道菌群为治疗靶标，可能对人体系统平衡起到很好地恢复作用[[xxviii]]。

色氨酸是哺乳动物中最普遍的必需氨基酸，可用于蛋白质的生物合成以及作为5-HT的生物前体。5-HT在全身的各个器官都有分布，是一种大脑神经递质、血小板凝血因子和神经激素[[xxix]]。通过研究血液和尿液中的色氨酸代谢物可以评估色氨酸是否缺乏。黄尿酸是一种光化学活性的色氨酸代谢产物，它是色氨酸代谢途径中甲基转移酶的底物。有研究报道通过CVS程序造模引起的抑郁模型大鼠尿液中黄尿酸水平下调[[xxx]]。

在我们的研究中，逍遥散可以升高抑郁症患者尿液中的黄尿酸含量，表明逍遥散的治疗效果可能是通过调节色氨酸代谢紊乱而产生。

牛磺酸，是中枢神经系统最丰富的氨基酸之一，具有抗惊厥等调节中枢神经功能的作用。有报道指出牛磺酸的缺乏可能是引发抑郁症的一个因素[[xxxi]]。另外，牛磺酸的增加在一定程度上可以缓解焦虑、抑郁。文献报道，富含牛磺酸的饮料对人的情绪和行为表现有非常积极的促进作用[[xxxii]]。在我们的研究中，逍遥散治疗后，抑郁症患者体内牛磺酸水平明显升高可能对患者抑郁、焦虑以及学习记忆有一定恢复作用。

总结

研究发现，逍遥散在抗抑郁症方面具有显著疗效，通过代谢组学的研究方法发现，抑郁症患者的代谢机制受到了干扰抑制，抑郁症患者血浆内的一些内源性代谢物产物发生了异常变化，而在逍遥散干预下逐渐回调；尿液代谢组学分析表明，逍遥散的治疗效果可能部分是基于对能量代谢、肠道微牛物、色氛酪代谢及牛磺酸代谢的有效调节。