放置时间对脐带血质量的影响

刘瑞，王凯，雒猛，姜东峰

（山东省脐带血造血干细胞库 山东 济南 250102 China）

摘要 目的：本实验旨在讨论脐带血在4℃冰箱中放置时间对其质量的影响。方法：将30份脐带血在4℃冰箱中分别放置1~10天，通过统计每天的有核细胞总数（TNC）、CD34⁺细胞总数、粒单系集落形成单位（CFU-GM）集落总数以及细胞活性进行分析。结果：通过比较发现，随着冷藏时间的延长，TNC逐渐降低，从第四天开始显著降低（P＜0.01）；CD34⁺细胞总数呈增加趋势，从第二天开始显著增加（P＜0.05）；CFU-GM集落总数和细胞活性也呈降低趋势，均从第二天开始显著降低（P＜0.01）；结论：为了确保检测结果的准确性，在脐带血的制备冻存过程之前，不宜在4℃冰箱中保存时间太久，最好在24小时内处理完成。

关键词：脐带血；CD34⁺；CFU-GM；TNC

中图分类号：Q2-33；R-33 文献标识码：A

The Effect of Place Time on Cord Blood Quality

LIU Rui  WANG Kai  LUO Meng  JIANG Dongfeng

Shandong Cord Blood Bank

Abstract Objective:The purpose of this experiment is to discuss the effect of umbilical cord blood place time on its quality in 4 ℃ refrigerator. Methods: put 30 copies of cord blood in 4 ℃ refrigerator respectively for 1 ~ 10 days, through statistical daily total nucleated cells (TNC), the total number of CD34 ⁺ cells, grain of single colony forming unit (CFU-GM) colony and total cell activity was analyzed. Results: by comparison, with the extension of refrigerating time, TNC gradually decreased and significantly decreased from the fourth day (P < 0.01). The total number of CD34⁺ cells increased significantly from the second day (P < 0.05). The CFU-GM population and cell activity also showed a decreasing trend, both significantly decreased from the second day

作者简介：刘瑞，（1987-），男，硕士，山东省齐鲁干细胞工程有限公司，中级工程师。研究方向：脐带血的临床应用。电话：15854131921，邮箱：lr1987617@126.com 

(P < 0.01). Conclusion: in order to ensure the accuracy of results, the preparation of cord blood cryopreserved is unfavorable in 4 ℃ refrigerator for a long time, the best processing was completed within 24 hours.

Key words：Cord Blood；CD34⁺；CFU-GM；TNC

脐带血（Umbilical cord blood， UCB）是胎儿分娩后残留在胎盘和脐静脉中的血液，通常是废弃不用的^[1]。但随着医学研究的不断发展，逐渐发现脐血中含有大量的造血干细胞。近几年，脐带血作为作为造血干细胞的主要来源之一，在临床移植上的应用也越来越广泛^[2]。而且，相对于外周血和骨髓来源的造血干细胞，脐带血有其自身的优势。脐带血资源丰富，采集方便并且不会对产妇和胎儿造成伤害^[3-4]。在移植要求上，脐血造血干细胞的HLA配对要求位点低。在移植以后脐带血造血干细胞更易存活，发生移植物抗宿主病的概率较低^[5-6]。

自上个世纪 80 年代脐血干细胞移植成功后，为了更好地利用和研究脐带血干细胞，世界各国脐血库应运而生，将原本废弃的脐带血，经分离、检测、深低温保存，以备临床应用;尤其是脐血干细胞在亲属间移植的成功，突显了脐血的临床价值^[7-8]。目前，大部分国家都制订了相应的法律法规和质量管理规范来控制和指导脐带血的临床应用和研究^[9]。尤其在我国，近几年，国家卫计委与国家食品药品监管总局更是规定干细胞制剂制备以药品生产标准进行管理，以促进干细胞临床研究健康开展^[10]。因此，我们应该严把质量关，更好的开发脐带血资源，为人类的健康服务。

1材料与方法

1.1实验器材：二氧化碳培养箱（Thermo，美国），流式细胞仪（BD，美国），血球计数仪（SYSTEM，日本），倒置显微镜（Olympus，美国），电子天平（上海友声衡器有限公司，国产）。

1.2实验材料：新鲜采集的脐带血，甲基纤维素培养基H4534（StemCell，美国），DMEM（HyClone，美国），HES（Braun，德国），溶血素（SYSTEM，日本）。

1.3实验方法：

1.3.1 选取新鲜采集的新生儿脐带血30份，并记录每份脐血的体积，放置在4℃冰箱中备用。样本放置时间分别为10天。每天对样本进行有核细胞总数（TNC）计数、CFU-GM实验、CD34⁺检测以及细胞活性检测。

1.3.2 有核细胞计数：三分类血球分析仪计数，通过白细胞浓度（WBC）计算TNC，TNC=WBC*体积

1.3.3 CFU-GM集落培养：采用甲基纤维素H4534培养基培养CFU-GM集落，该培养基没有促红细胞生成素（EPO）。实验使用48孔板，每个样本加样三个孔，每孔加样10000个细胞，在二氧化碳培养箱中培养14天，观察CFU-GM集落，细胞数大于40计为一个集落。

1.3.4 CD34⁺细胞检测：采用流式细胞仪检测CD34⁺细胞百分比。通过TNC计算CD34⁺细胞总数。

1.3.5 细胞活性：通过台盼蓝拒染实验观察细胞活性。

1.4 结果分析：使用SPSS对实验数据进行统计学分析，计量结果均采用配对样本t检验。计量数据采用：“平均数±标准差`x±s”。P＜0.05认为具有统计学意义。

2. 结果：

2.1 放置时间对TNC的影响 从表1中可以看出随着放置时间的延长，TNC逐渐降低，从第四天开始降低极为显著(P＜0.01)，从图1中也可以看出下降趋势十分明显。

表1 放置时间对TNC的影响（N=30，×10⁸，x ± s）

**P＜0.01

图1 放置时间对TNC影响

2．放置时间对CD34⁺的影响 从表2中可以看出，随着放置时间的延长，CD34⁺呈现增多的趋势，从第二天开始增加显著（P＜0.05），从第八天开始增加极为显著（P＜0.01）；从图2也可以看出随着放置时间的延长，CD34⁺呈现增加的趋势。

表2 放置时间对CD34⁺的影响（N=30，×10⁶，x ± s）

*P＜0.05；**P＜0.01

图2 放置时间对CD34⁺的影响（N=30）

3.放置时间对CFU-GM和活性的影响 从表3.1和3.2中可以看出，随着放置时间的延长，CFU-GM总数和活性逐渐降低，从第二天开始降低极为显著（P＜0.01）；从图3.1和3.2中也可以看出随着放置时间的延长，CFU-GM总数和活性呈现降低趋势。

表3 放置时间对CFU-GM和活性的影响（N=30，×10⁶，x ± s）

**P＜0.01

图3.1 放置时间对CFU-GM的影响

图3.2 放置时间对细胞活性的影响

讨论：

在很多实验室和临床应用上，已经证明脐带血中的造血干细胞具有更原始、更强的增殖分化能力。脐血中的CD34⁺细胞群在质量数量和增殖能力上都强于外周血^[11]。而在脐带血移植过程中，有核细胞总数（TNC）、CD34⁺、粒单系集落形成单位（CFU-GM）集落总数以及细胞活性是衡量脐带血质量的重要指标^[12]。 但由于受医院设备条件和地理等因素的限制 ，脐血采集与上机检测时间往往不能紧密衔接 ，导致影响检测结果 。因此，检测时间对于上述脐带血质量的四个指标有着重要的意义^[13]。

本实验中，随着放置时间的延长，CD34⁺细胞不断增加，这与其他文献中所报道的结果不一致^[14]，分析原因①CD34⁺细胞可以进行自我复制；②也能够在活化因子的作用下分化成CD34⁺造血干细胞的能力有关^[15]。所以，短时间内CD34⁺细胞数是有可能增加的，但从长期来看，CD34⁺细胞数还是会随着时间的延长呈现降低的趋势。有文献表明，TNC与CD34⁺细胞具有良好的相关性，脐血移植的效果，取决于输入的造血干细胞数量^[16]。在4℃环境中，随着放置时间的延长，细胞会不断的裂解凋亡，造成了TNC不断减少；CFU-GM能够反映造血干细胞的增殖分化能力，与造血重建的快慢和抑制率有关^[17]。在造血干细胞移植中，其也作为评价脐血移植能力的重要指标。实验中CFU-GM随时间延长逐渐减少的原因可能是：①在4℃环境中，一部分淋巴细胞、粒细胞和血小板会裂解，而它们的裂解物对CFU-GM有抑制作用；②也有可能是在4℃环境中，脐带血会不断丢失造血因子，其活性也会不断降低，而造血因子活性与CFU-GM形成具有密切的关系；移植的细胞活性将直接影响移植治疗效果，在4℃环境中，随着放置时间的延长，细胞活性不断降低，这和细胞的凋亡有关。而Tonn^[18]等证实即使台盼蓝活性检测99%，干细胞的移植能力依然明显下降。本实验发现细胞活性在第十天只下降到90%，而TNC已经从12.13*10⁸下降到7.76*10⁸，细胞数下降了36%，也说明了这个问题。综上所述，在4℃环境中，随着放置时间的延长，脐带血的TNC、CFU-GM以及细胞活性都在降低，影响了脐带血造血干细胞的质量，因此在脐带血采集以后，为了保证脐带血的制备质量，应该及时处理，进行深低温保存，以备临床应用。

参考文献

[1] 唐晓鹏，王文龙，张旻，等. 脐血有核细胞输注治疗慢性肝衰竭的初步临床观察[J]. 中国输血杂志，2008，21(6)：420-423.

[2] 黄志行，田春芳. 脐带血的研究现状及其临床应用进展[J]. 医学综述，2015，21(8):1375-1376.

[3] Forraz N, Mcguckin CP. The umbilical cord: a rich and ethical stem cell source to advance regenerative medicine [J]. Cell Proliferation, 2011, 44(l1): 60-69.

[4] 吴洁莹，陆琰，陈劲松，等. 脐带血血浆分离培养脐带间充质干细胞及体外扩增人脐血CD34 + 细胞的研究[J]. 中国实验血液学杂志，2015，23(4): 1112-1119.

[5] Butler MG，Menitove JE． Umbilical cord blood banking: an update[J]. J Assist Reprod Genet，2011, 28(8):669-676.

[6] Nitsche A. Inhibition of cord blood cell expansion by human herpesvirus 6 in vitro. Stem Cells Dev, 2004,13(2):197-203.

[7] Shahrokhi S，Menaa F，Alimoghaddam K，et al． Insights and hopes in umbilical cord blood stem cell transplantations[J]. J Biomed Biotechnol，2012，2012:572821.

[8] 武文杰，刘剑，李茜，等．自体脐带血的保存及临床应用[J]．中国实验血液学杂志，2013，21(5):1365-1368.

[9] 彭珊，高随祥，彭世祥. 脐带血造血干细胞库质量控制研究[D]. 中国科学院大学，2014.

[10] 中国医药生物技术协会. 干细胞制剂制备质量管理自律规范[J]. 中国医药生物技术，2016，11(6): 481-490.

[11] 徐长根，朱阳泉，李浩，等. -80℃下不同冻存时间对脐血造血干细胞保存效果的影响[J]. 临床输血与检验，2010，(02):104-106.

[12] 汪健，黄璐，宋瑰琦，等. 深低温冻存不同时间对脐血细胞质量的影响[J]. 中国实验血液学杂志，2013(01): 177-180.

[13] 宋建新，沙玲. 外周血干细胞移植中标本放置时间对CD34^＋细胞及单个核细胞计数结果的影响[J]. 2014，35(5): 2987-2988.

[14] Gutensohn K, Hummel K, Sputtek A, et al. Storage of peripheral blood stem cell samples alters flow cytometric CD34⁺ results.[J]. Beitr Infusionsther Transfusionsmed, 1996, 33:170-174.

[15] Huss R. CD34⁺ stem cells as the earliest precursors of hematopoietic progeny[J]. Exp Hematol, 1998, 26:1022.

[16] 许遵鹏，廖灿，陈劲松，等. 影响脐血造血干细胞移植供体品质的相关因素分析[J]. 中国实用儿科杂志，2008，(11):823-826.

[17] 刘晋辉，何吉，陈舒，等. 不同培养体系对脐血造血干细胞粒细胞-巨噬细胞集落形成单位的影响[J]. 中华移植杂志，2012，6(2):40-42.

[18] Seeger F H, Tonn T, Krzossok N, et al. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction[J]. European Heart Journal, 2007, 28(6):766.