江西农业经济稿件信息
大豆灰霉病、黑斑病拮抗菌株的筛选和鉴定
吉丽，田磊，田春杰
（中国科学院 东北地理与农业生态研究所 黑土区农业生态重点实验室，吉林 长春130102）
摘 要：生物防治病虫害是当前农业可持续发展的重要方向之一。大豆灰霉病、黑斑病是大豆的主要病害，为了通过生物防治的方法控制灰霉病和黑斑病对大豆的危害，采用土壤稀释法从江西东乡野生稻根际土壤中分离获得64株拮抗菌，经反复筛选及平板对峙法测定菌株A2、A6、A10、F7、G6对大豆灰霉病菌（Botrytis cinerea）和黑斑病菌（Alternaria alternata）有稳定拮抗作用。菌株发酵滤液和化学农药抑菌效果比较结果可知，拮抗菌的发酵滤液的抑菌率均远超化学农药的抑制率。根据菌株的生理生化特征及16S rDNA分子鉴定，5株菌分别为米修链霉菌(Streptomyces misionensis)、绛红产色小单孢菌(Micromonospora purpureochromogenes)、圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)、链霉菌(Streptomyces sp.)、类芽孢杆菌(Panenibacillus sp.)。本研究期望为大豆灰霉病、黑斑病的生防菌开发和利用提供一定的理论依据。
关键词：灰霉病；黑斑病；拮抗；生物防治
中图分类号：S435.2 文献标识码：A
Screening and Identification of Antagonistic Strains of Soybean Gray Mold and Black Spot
JI LI，TIAN Lei，TIAN Chunjie
(Key Laboratory of Mollisols Agroecology, Northeast Institute of Geography and Agroecology, CAS, Changchun 130102, China)
Abstract: Biocontrol method inhibiting fungal pathogenesis is one important aspect for agricultural sustainable development. Gray mold and black spot diseases are the main diseases of soybeans. In order to better control gray mold and black spot, 64 strains of antagonistic bacteria were isolated from the rhizosphere soil of wild rice in Jiangxi Province by soil dilution method. Strains A2, A6, A10, F7 and G6 showed stable antagonism to gray mold and black spot by repeated screening and plate confrontation assay. The results showed that the inhibitory rate of the
antagonistic fermentation filtrate was much higher than that of the chemical pesticide. According to the physiological and biochemical characteristics of strain and identification of 16S rDNA, the five strains were Streptomyces misionensis, Micromonospora purpureochromogenes, Streptomyces ansochromogenes, Streptomyces sp., and Panenibacillus sp.. The results of this study provide a theoretical basis for the development and utilization of biocontrol bacteria for soybean gray mold and black spot.
Key words: gray mold；black spot；antagonistic；Biological control
0 引 言
大豆是我国重要的粮油兼用作物，在粮食结构中占有重要地位[1]。大豆病害中以真菌病害为主[2]，其中以灰霉病、黑斑病最为常见。灰霉病由葡萄孢属真菌（Botrytis sp.）引起的病害[3]，又称灰腐病、白点病，能侵染包括茄科、葫芦科、蔷薇科、豆科等400余种植物，并且可侵染寄主植物的各个部位[4]。大豆黑斑病多由真菌半知菌亚门簇生链格孢菌Alternaria fasciculate (Cooke et Ell.)Jones et Grout引起[5]，会侵染大豆整个生长时期，从而引发大豆病害。大豆黑斑病在吉林、辽宁、黑龙江、江苏、四川等省份均有分布[6]。从已有的报道得知，黑斑病不仅侵染大豆，在人参、柑橘、甘蓝、枣果、黄瓜、月季等植物上也均具有致病性[7-12]。目前控制大豆灰霉病和黑斑病的主要方法仍是以化学杀菌剂为主，另外有数据表明虽然我国耕地面积只有全世界的8%，但化学农药用量却占全球35%，位居世界第一[13]。化学农药虽在短时间内有良好的经济效益，但随着时间推移化学农药造成的诸多问题也日益显现[14]。鉴于农残隐患以及绿色有机农业发展需求，生防菌剂的开发和应用迫在眉睫。其中部分生防菌如多粘类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、假单胞菌、以及酵母菌、木霉菌和链霉菌等良好的生防效果已得到验证[15-20]，并且对植物的生长还有一定促进作用。
在不同病原菌引起的植物侵染性病害中，约有70%的病害是由真菌引起的[21]。而真菌细胞壁的3%~60% 是由几丁质构成的[22]，因此本文以筛选分解真菌细胞壁的重要成分几丁质为出发点，利用平板对峙法进一步筛选对大豆灰霉病、黑斑病有抑制作用的拮抗菌株，期望为灰霉病、黑斑病的预防和治疗起到一定作用，同时更期望为开发具有应用价值的生防菌剂以及生物农药奠定基础，从而为绿色有机农业奠定长远发展，也为后续高效的生防菌剂开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种来源
供试菌株大豆病原菌即灰霉病（Gray mould）与黑斑病( Alternaria alternate)由吉林农业大学植物病理系高洁教授和卢宝慧讲师提供。
1.1.2 培养基
几丁质培养基：K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1g，琼脂15 g加蒸馏水定容至1000 ml，其中每80 ml几丁质培养基中加入20 ml1%胶体几丁质。PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1000 ml，pH自然。发酵培养基：葡萄糖10.0 g，酵母浸膏7.5 g，加蒸馏水定容至1000 ml。
1.2 试验方法
1.2.1 土壤样品采集
采用五点取样法，收集江西东乡地区（东经116.61，北纬28.23）野生稻的根际土于无菌自封袋内，放于室温内备用。
1.2.2 拮抗菌株的分离、纯化
采用平板稀释涂布法，称取5 g土样放于装有45 ml无菌水的三角瓶中，120 rpm，震荡20 min后静置5 min，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10-1、10-2、10-3浓度的稀释液各80 μL，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25 ℃培养箱中培养2~3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。
在几丁质培养基上，挑选透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别单独挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，编号，4 ℃保存。
1.2.3 拮抗菌的筛选
采用平板对峙法，测定拮抗菌株对黑斑病和灰霉病的抑菌活性。先将灰霉病、黑斑病在PDA平板上进行活化，挑选长势旺盛的灰霉病和黑斑病病原菌平板，用打孔器制成直径为7 mm的菌饼，倒置于PDA平板，将拮抗菌菌饼接种在距病原菌约2 cm处，其中以不接拮抗菌的平板为对照，每组3个重复，置于26 ℃下恒温培养箱中培养2~6天，观察抑菌圈的大小。并在第2、4、6天的时候记录病原菌的菌落最小半径以及对照菌落的半径，计算抑菌率。
计算公式：抑菌率（%）=（对照菌落半径-病原菌菌落半径）/对照菌落半径×100。
将初筛得到抑制效果较好的菌株的菌饼接种于121 ℃下高压灭菌过的发酵培养基中，置于26 ℃摇床，160 rpm恒温震荡48小时后，无菌纱布三层过滤，将不同菌株的滤液5000 rpm离心5分钟收集菌体，无菌水洗涤2次后重悬浮无菌水中，血球计数板测定浓度并将其稀释浓度为107 cfu/ml，备用。
1.2.4 菌株发酵液和化学农药对灰霉病和黑斑病抑制效果比较
农药稀释液制备：将市售灰霉病特效素（北美农大）和50%苯醚甲环唑（北美农大）按照使用说明分别对灰霉病特效素和苯醚甲环唑分别进行了250倍稀释和500倍稀释。
拮抗试验：分别取100 μl 拮抗菌的发酵滤液、250倍灰霉病特效素稀释液、500倍灰霉稀释液、250倍苯醚甲环唑稀释液、500倍苯醚甲环唑稀释液涂布于PDA平板，平皿中央分别接种7 mm活化后的灰霉病、黑斑病病原菌菌饼，以无菌水为对照，每组3个重复，26 ℃下恒温培养，在第2、3、4、5天测量病原菌的直径，计算抑菌率。
计算公式：抑菌率（%）=（对照菌落直径-病原菌菌落直径）/对照菌落直径×100%
1.3 菌株鉴定
1.3.1 菌落形态观察与生理生化鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，对拮抗菌株进行形态学观察及生理生化鉴定，其中主要包括硝酸盐还原试验、接触酶反应、甲基红反应、V-P测定、淀粉水解、明胶液化、硫化氢反应、吲哚反应、耐盐性（2%、5%、7%、10%）。
1.3.2 16S rDNA序列扩增及系统发育分析
利用CTAB方法提取菌株的基因组，进行16S rDNA的扩增。PCR通用引27 F（5ˊ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ˊ），1492 R （5ˊ-GGTTACCTTGTTACGACTT-3ˊ），反应体系25 μl，Premix version 2.0 12.5 μl，27 F (10 μM) 1 μl，1492 R(10 μM)1 μl，DNA模板1 μl，无菌水补足至25 μl。反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。扩增产物送到生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，所得序列上传到GenBank数据库。通过Blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用Mega 5.1 软件中Neihbor-Joinhing 构建系统发育进化树。
1.4 数据分析
应用Excel 2003和Graphpad Prism 6结果统计和数据处理。
2 结果分析
利用几丁质培养基，从江西东乡野生稻根际土壤中获得64株产透明圈较大的可分解几丁质的菌株。通过平板对峙法测定了拮抗菌株与灰霉病、黑斑病的拮抗效果，其中有5株拮抗菌（A2、A6、A10、F7和G6）对灰霉病和黑斑病有稳定的拮抗效果（图1，图2）。通过第2、4、6天对灰霉病和黑斑病菌落半径的测量，得出抑菌率。从表1可知，拮抗菌株对灰霉病与黑斑病均有抑制作用，虽效果不同，但整体随着拮抗天数增加呈上升趋势。其中菌株A2和G6对灰霉病表现出较突出的抑制作用，在2~6天，拮抗作用分别在78.25%和77.46%之上。对于黑斑病，菌株A2、F7和G6相对更加优势，对黑斑的抑制率分别可达78.66%、77.47%和79.94%。
图1 5株拮抗菌对灰霉病的平板拮抗效果
Fig. 1 The antagonistic effects of 5 strains of antagonistic bacteria against greymould
图2 5株拮抗菌对黑斑病的平板拮抗效果
Fig. 2 The antagonistic effects of 5 strains of antagonistic bacteria against black spot disease
表1 不同天数拮抗菌株对灰霉病、黑斑病的抑制率
Tab. 1 Inhibition rate of antagonistic strains on grey mould and black spot in different days
|
|
|
2天 Two days |
4天 Four days |
6天 Six days |
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灰霉病 Grey mould |
A2 |
78.25±3.54 |
88.85±2.30 |
93.1.41 |
|
A6 |
43.49±7.09 |
53.06±4.82 |
45.89±1.11 |
|
|
A10 |
44.29±2.97 |
42.04±3.28 |
47.27±1.75 |
|
|
F7 |
27.30±3.90 |
44.29±2.97 |
54.05±3.18 |
|
|
G6 |
77.46±5.64 |
93.04±1.41 |
||
|
黑斑病 Black spot |
A2 |
66.03±3.31 |
56.99±5.30 |
78.66±1.74 |
|
A6 |
55.71±2.97 |
54.44±2.94 |
58.79±1.38 |
|
|
A10 |
61.27±2.82 |
50.00±1.92 |
62.64±3.53 |
|
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F7 |
66.03±3.31 |
63.65±1.95 |
77.47±5.50 |
|
|
G6 |
66.03±3.31 |
68.26±1.59 |
79.94±1.56 |
2.2菌株发酵液和化学农药的抑菌效果
通过拮抗菌株发酵液与农药稀释液的抑菌效果结果得知，随着天数的增加，拮抗菌的抑菌作用越来越强，而化学农药越来越弱。如图3，我们得知在第5天时，拮抗菌株对灰霉病的抑制率能达到91.7%，而灰霉病特效素对灰霉病的抑制作用，随着天数的增加而降低，第二天的抑制效果最佳为68%。从拮抗菌与苯醚甲环唑对黑斑病的抑制作用结果（图4）可知，A2、F7和G6随着天数增加，对黑斑抑制效果整体呈现上升趋势，分别在第5天时，抑制效果达83.33%、86.66%和85.66%。A6在第4天抑制效果最佳达87%，而A10在第5天的抑制效果最佳为60.9%。苯醚甲环唑随着天数的增加抑菌效果逐渐降低，第二天的抑制最好为47.33%。
图3 拮抗菌与灰霉病特效素在不同天数对灰霉病的抑制效果
Fig. 3 Inhibitory effect of antagonistic bacteria and Botrytis cinerea specific on gray mold in different days
Fig. 4 Inhibitory effect of antagonistic bacteria and diphenoxazole on black spot in different days
2.3拮抗菌生理生化特性及16S rDNA 序列分析
经生理生化试验测定，菌株A2接触酶阴性，菌株A6、A10、F7和G6接触酶阳性，菌株A2、A6、A10、F7和G6甲基红反应，V-P反应以及吲哚反应均为阴性，不产生硫化氢，明胶液化，淀粉水解均为阳性，对NaCl的耐受性较高，在 10% NaCl含量下仍能生长（表2）。
表2 拮抗菌的部分生理生化特性
Tab. 2 Physiological and biochemical characteristics of of antagonistic bacteria
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接触酶 Contact enzyme |
甲基红 Methyl red |
V-P V-P reaction |
吲哚 Indole reaction |
明胶 液化 Gelatin liquefaction |
硝酸盐 还原 Nitrate reduction |
淀粉 水解 Starch hydrolysis |
最高耐盐性 Highest salt tolerance |
|
A2 |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
+ |
10% |
|
A6 |
+ |
- |
- |
- |
+ |
- |
+ |
10% |
|
A10 |
+ |
- |
- |
- |
+ |
- |
+ |
10% |
|
F7 |
+ |
- |
- |
- |
+ |
- |
+ |
10% |
|
G6 |
+ |
- |
- |
- |
+ |
- |
+ |
10% |
注：“-”阴性，“+”阳性
菌株A2、A6、A10、F7和G6经DNA测序后分别得到1431 bp、1422 bp、1438 bp、1431 bp和1428 bp序列。将DNA序列在NCBI数据库Blast比对后，经Mega 5.1构建系统进化树如图5所示，其中A2与Streptomyces misionensis、Streptomycetaceae、Streptomyces sp.的聚类到一起；A6、A10、F7、G6分别与Micromonospora purpureochromogenes；Panenibacillus sp.；Streptomyces ansochromogenes；Streptomyces sp.、Streptomyces hygroscopicus聚类到一起。结合菌株的生理生化特征，将A2鉴定为Streptomyces misionensis（米修链霉菌）；A6鉴定为Micromonospora purpureochromogenes（绛红产色小单孢菌）；A10鉴定为Panenibacillus sp.（类芽孢杆菌）；F7鉴定为Streptomyces ansochromogenes（圈卷产色链霉菌）；G6鉴定为Streptomyces sp.（链霉菌）。
图5 菌株A2(a)
